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[摘要]筛查雷公藤多苷片肝毒性产生的特征性生物标志物，并初步探讨其可能的作用机制，为雷公藤多苷片肝毒性提供可能的辅助检测指标和筛查诊断的方法。采用液相色谱质谱方法测定空白组大鼠与口服雷公藤多苷片高剂量模型组大鼠代谢指纹谱，利用多元统计分析方法比较2组的代谢谱差异，筛选出可能的潜在生物标志物。实验共筛选出20个在模型组中与正常组中差异性较大的代谢物（VIP>10），分析鉴定了7个代谢物，分别为6磷酸葡萄糖胺、溶血磷脂、色氨酸、胍基乙酸、3吲哚丙酸、可的松和泛醌，其代谢水平的变化表明氨基酸代谢、糖代谢、磷脂代谢和激素代谢等途径发生紊乱。由此推测雷公藤多苷片致肝损伤可能与三羧酸循环中能量代谢和尿素循环中氨基酸代谢，以及糖代谢异常有关，该研究可为今后进一步研究雷公藤肝毒性提供一定的数据支持。
[关键词]雷公藤多苷； 肝毒性； 代谢组学； 代谢物分析
[Abstract]In this paper， biomarkers of liver toxicity of Triptergium wilfordii based on metabolomics was screened，and mechanism of liver toxicity was explored to provide a reference for the clinical diagnosis for liver toxicity of Triptergium wilfordiiMS method was carried on the analysis to metabolic fingerprint spectrum between treatment group and control group The potential biomarkers were compared and screened using the multivariate statistical methods As well， metabolic pathway would be detailed description Combined with PCA and OPLSDA pattern recognition analysis， 20 metabolites were selected which showed large differences between model group and blank group（VIP>10） Seven possible endogenous biomarkers were analyzed and identified They were 6phosphate glucosamine， lysophospholipid， tryptophan， guanidine acetic acid， 3indole propionic acid， cortisone， and ubiquinone The level changes of above metabolites indicated that the metabolism pathways of amino acid， glucose， phospholipid and hormone were disordered It is speculated that liver damage of T wilfordii may be associated with the abnormal energy metabolism in citric acid cycle， amino acid metabolism in urea cycle， and glucose metabolism It will be helpful to further research liver toxicity ingredients of Triptergium wilfordii
[Key words]tripterygium glycosides； liver toxicity； metabonomics； metabolites analysis
中药药源性肝损害是指在治疗过程中，由于中药代谢及其代谢产物引起的肝细胞毒性损害，或肝脏对中药及代谢产物过敏反应所致疾病。近年来，药源性肝损害的报道逐渐增多，尤其是由中药而引发的急慢性肝损害的临床报道呈逐年上升的趋势，已成为临床较为常见和易产生严重后果的药源性疾病[12]。据不完全统计，约有100多种中草药和30多种中成药可引起肝脏损害[3]。
雷公藤是我国一味传统中药，性温，味苦涩，具有祛风除湿、舒经活络、消肿止痛、杀虫解毒等功效。在临床上治疗类风湿性关节炎、红斑狼疮、肾病综合征等自身免疫系统疑难病症有良好的效果，其独特的疗效，几乎没有可以完全替代的类似中药。然而，在众多中药药源性不良反应的报道中，雷公藤不良反应报道居多，已引起国内外学者对雷公藤的肝毒性成分和毒性机制的高度关注。雷公藤多苷作为雷公藤提取物制剂，广泛用于临床治疗类风湿性关节炎、原发性肾小球肾病、肾病综合征、紫瘢性及狼疮性肾炎、红斑狼疮、亚急性及慢性重症肝炎、慢性活动性肝炎；亦可用于过敏性皮肤脉管炎、皮炎和湿疹，以及银屑病性关节炎、麻风反应、白噻氏病、复发性口疮、强直性脊柱炎等难治自身免疫性疾病，但其严重的肝肾毒性及生殖毒性制约了临床应用，因此开展雷公藤多苷毒性机制的研究具有重要的临床意义和科学意义。为此，本文采用LCMS检测雷公藤多苷致肝损伤大鼠内源性代谢指纹图谱，通过主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别（PLSDA）分析，筛选雷公藤多苷致肝损伤的潜在代谢组学生物标志物，并结合代谢通路数据库，探讨可能的中毒机制和通路，为雷公藤致肝损伤疾病的诊断和研究提供参考。
1材料与方法
1.1仪器
超高效液相色谱质谱串联四极杆飞行时间质谱仪（UPLCQTOF，AcquityQTOF Premier，美国 Waters 公司），Masslynx 41 工作站；Gradient A10 MillQ超纯水器（法国Millipore公司）；冷冻离心机（Sigma，德国）；Oymptls光学显微镜；振荡涡旋仪（HYQ 2121A）；AL204 电子天平（METTLER TOLEDO）；自动生化仪（mindray BS300）；冷冻离心机（Sigma，德国）。
1.2药材与试剂
雷公藤多苷片（国药准字233020422，规格10 mg/片，批号1106102）。天门冬氨酸氨基转氨酶（AST），丙氨酸氨基转氨酶（ALT）由深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司提供。甲醛溶液；乙腈，甲醇，甲酸（色谱级，Merck 公司）；去离子水（ 18.2 MΩ） Millipore MilliQ 系统（Millipore Co，美国）经超纯水器净化；亮氨酸脑啡肽（Leucineenkephalin，LE）标准品购于Sigma公司（USA），其他试剂为市售分析纯。
1.3动物与分组
SD大鼠，SPF 级，（160±20） g，动物合格证号[SCXK（军）2007004]，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，实验动物分笼饲养于解放军302医院实验动物中心。每笼4只，托盘和笼具是每周消毒后再用。每日清洗更换粪尿盘。基础饲料是实验鼠全价颗粒饲料，由北京军事医学科学院实验动物研究中心提供。空白组、低剂量组和高剂量组各10只大鼠，雌雄各半。
1.4给药方法
人用临床常用剂量为l～15 mg·kg-1·d-1 （依照药品说明书），按体表系数换算，大鼠为75 mg·kg-1·d-1，即075 mg·100 g-1·d-1实验设临床常用等效剂量及其20倍等效剂量组分别为低和高剂量组。将雷公藤多苷片研磨成粉末加生理盐水充分溶解，将药物按低和高剂量分别配制成质量浓度为 075，15 g·L-1的混悬液。分别按 75，150 mg·kg-1·d-1给药，每天上午9：00—10：00灌胃[4]，正常组每天灌以等量生理盐水。每周称重1次，按实际体重调整剂量。随机方法：将动物按体重、性别随机取出分配到各组。
1.5血清肝酶检测及肝组织病理组织形态学检查
给药组大鼠每周在灌胃后半小时眼眶取血，每周1次，4 ℃1万 r·min-1冷冻离心10 min，取上清液，用全自动生化仪检测天门冬氨酸氨基转氨酶（AST）和丙氨酸氨基转氨酶（ALT）[5]。各组大鼠处死后，立即取出肝脏组织，生理盐水清洗，伊红苏木精（hematoxylineosin，HE）染色病理组织形态学检查。取肝右叶外侧下部肝脏组织（15×15） cm2的（一般厚度不超过05 cm），4%中性甲醛溶液固定24 h，肝脏边缘切取薄片，10%中性甲醛溶液固定72 h，维持组织形态结构。经脱水透明、浸蜡包埋、切片与贴片、脱蜡染色、透明脱水并封固后，光学显微镜下观察，拍照[5] 。
1.6血清处理
空白组及高剂量肝毒性大鼠血清保存在-80 ℃冰箱中，取出复融后，取250 μL加入到15 mL EP管中，再加入750 μL甲醇溶液，混匀，静置，4 ℃ 1万 r·min-1冷冻离心10 min，取上清，并用022 μm微孔滤膜滤过，备用。
1.7数据处理
采用 SPSS 160 软件统计，各项指标结果以±s描述，进行组间数据比较，若符合正态分布用完全随机设计资料单因素方差分析。2样本比较，其中方差齐性者采用 LSD 法检验，方差不齐者采用 Dulmets 法检验。
1.8LCMS条件
1.8.1色谱条件Waters UPLC HSS T3 色谱柱（21 mm×100 mm， 17 μm）； 流动相A为（1%甲酸水溶液），B为ACN （含01%甲酸），梯度洗脱程序见表1；流速035 mL·min-1；进样量5 μL；柱温35 ℃；样品温度4 ℃。
1.8.2质谱条件离子源ESI±；毛细管电压32 kV；锥孔电压50 V；Extraction Cone 3 V；离子源温度100 ℃，Desolvation 350 ℃；脱溶剂气流量700 L·h-1；扫描范围m/z 50～1 000；每次扫描 02 s；2次扫描时间间隔002 s；锁定质量校准模式DRE，亮氨酸脑啡肽（200 μg·L-1 Lockmass）在线校正。
1.9数据分析
采用沃特世公司MassLynx 41软件中的MarkerLynx软件进行色谱峰识别，再将数据导入EZinfo 20软件进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLSDA）模式的识别分析。生物标志物的筛选是根据VIP值（VIP>1）、载荷图和得分图进行筛选，再进行t检验（P<005）排除没有显著性差异的化合物。根据文献再结合数据库中查找相关信息物质。
2结果
2.1雷公藤多苷对大鼠体重的影响
雷公藤多苷灌胃3周后，与空白组的大鼠相比，高剂量组大鼠体重增长抑制作用，（P<005），低剂量组大鼠的体重没有明显的变化；雷公藤多苷灌胃4周后，与空白组的大鼠相比，高剂量组和低剂量组大鼠的体重明显下降（P<005）。提示，雷公藤多苷灌胃后，给药3，4周后高剂量组大鼠体重降低（P<005，P<001），具有统计学意义；给药4周低剂量组大鼠体重下降（P<001），具有统计学意义，见表2。
2.2对大鼠血清ALT，AST的影响
与正常组的大鼠相比，给药 3 周后，高剂量组 ALT 显著性升高（P<005），AST 也明显升高（P<005）；低剂量没有显著性差异，没有统计学意义。给药 4 周后，与正常组的大鼠相比，低剂量组AST（P<001）和ALT（P<005）以及高剂量组AST（P<0001）和 ALT（P<0001）都显著性升高，具有统计学意义，见表3。提示，血清中肝酶活性增加，说明肝组织出现损伤而将 AST，ALT 酶释放入血，且雷公藤多苷对大鼠肝组织的损伤，与给药时间和给药剂量呈正相关。
2.3对大鼠肝组织病理切片的影响
正常组的大鼠肝组织切片结构正常，肝细胞大小一致，中央静脉周围的肝细胞索排布，无脂肪变性细胞，细胞质丰富，细胞核位于细胞中央；低剂量组的大鼠肝组织结构基本正常，肝细胞大小不一致，个别肝细胞脂肪变性，偶有凋亡小体，易见溶解坏死，较多点片状坏死，淋巴细胞少见聚集，可见空泡状核肝细胞；高剂量组的大鼠肝细胞大小不一，明显脂肪病变，易见溶解坏死，以淋巴细胞为主，较多点片状坏死，见图1。
2.4雷公藤致肝损伤大鼠血清PCA主成分分析
空白组与高剂量组的大鼠能够明显区分开来，见图2，说明，高剂量组大鼠给予雷公藤多苷片造成肝损害后，生理代谢环境被明显干扰，病理状态下代谢网络的出现某些环节的紊乱，可能是低分子代谢物出现质或量的变化。在空白组中有一个大鼠没有归属于任何一组，说明，除病理因素外，个体差异如：年龄、生活习惯等多种因素都会对机体内源性代谢物产生影响。
为了进一步探讨雷公藤致肝损伤所引起的血清代谢差异，找到相关的雷公藤致肝毒性相关的代谢通道的变化。实验采用监督性OPLSDA的数学建模对正常组大鼠和高剂量组大鼠血清样本重建模型见图3，放大它们之间的差异，用以评估造成上述分离的差异变量。结果表明，高剂量大鼠体内内源性代谢物与正常大鼠存在明显的差异。在建立的OPSLDA模型基础上，通过VIP（variable importance in the projection）和载荷权重（loading weight）多维统计分析来筛选雷公藤致肝毒性引起的差异性变量，见图4，5。载荷矩阵图能反映各个变量对样品分型的影响，这些变量距离载荷矩阵图中心的距离越远，表明其对“得分矩阵”的影响越大，其数值愈大，表明该种物质对分组贡献愈大，是将空白组大鼠和高剂量组大鼠血清样品能够被完全区分开来的关键代谢物，可被认为是影响紊乱大鼠的内源性代谢物，即为潜在的雷公藤致肝损害生物标志物。同时在载荷图上表现为距离原点越远的变量，这些变量在Splot图上也表现出与主成分良好的相关性。
生物标志物的筛选是根据VIP（VIP>1）、载荷图和得分图进行筛选，并对这些变量应用SPSS 130软件行t检验，取P<005认为具有统计学意义，排除没有显著性差异的化合物。对关键代谢产物筛选后，应用此方法共找出了20个差异变量具有显著分类意义的代谢产物，再利用UPLCQTOFMS测得的精确分子离子，借助 Waters公司的MassLynx软件中的 iFIT功能，对所筛查到的具有显著性差异的代谢物进行分析，计算其可能的分子式。同时将代谢产物的精确的分子离子在下列数据库中进行数据识别。如KEEG，Biocyc，Human Metabolome Database，PathDB，UMBBD，BRENDA等中找出对应物质，其中筛选鉴定了7个可能的代谢物，见表4。
3讨论
上述实验结果表明，与空白组大鼠相比，灌胃3周后，高剂量大鼠体重下降，血清AST和ALT酶值显著性升高；灌胃4周后，低剂量组和高剂量组大鼠明显体重下降，肝脏指数和血清 AST 酶都显著性增大，具有统计学意义；肝组织病理切片与北京解放军302 医院的药源性肝损伤的病理报告的比对较一致，具有明显的肝细胞损伤[6]。提示，雷公藤制剂可致药源性肝损害，且与给药时间和给药剂量呈正相关[7]。本实验采用UPLCQTOFMS技术，运用代谢组学方法分析，能将空白组和雷公藤致肝毒性大鼠的高剂量组血清在PCA 和OPLSDA模型上完全分开。共找到了20个肝毒性大鼠与正常大鼠中差异性较大的代谢物（VIP>10）。通过KEEG，Biocyc，Human Metabolome Database，PathDB，UMBBD，BRENDA等中找出对应物质，指认了7个，它们代谢水平的变化说明雷公藤肝毒性可引发氨基酸代谢、糖代谢、磷脂代谢和激素代谢等途径发生紊乱。
机体接受刺激（外源性物质或环境等因素）后，体内的代谢水平会有所改变，它们的变化代表了基因、转录和蛋白变化的最终结果，因此本实验采用代谢组学的方法来反应雷公藤肝毒性情况。雷公藤造成肝损伤后，主要影响了大鼠体内氨基酸代谢、糖代谢、磷脂代谢和激素代谢等途径，见图6。
胍基乙酸是尿素循环和氨基酸代谢的代谢产物，参与多种氨基酸（甘氨酸、丝氨酸、精氨酸和脯氨酸）的代谢，并由甘氨酸和精氨酸催化生成。在雷公藤多苷肝损伤组的血清中，胍基乙酸水平明显低于空白组，推测与尿素循环和氨基酸代谢有关。雷公藤多苷造成肝损伤时，引起脂质过氧化[8]，一方面体内NADH/NAD+比例增高，参与TCA循环的NADH/NAD+依赖的关键酶异柠檬酸脱氢酶和α酮戊二酸脱氢酶复合酶被抑制，进而影响柠檬酸和α酮戊二酸的生成，抑制TCA循环，能量代谢被抑制的同时，延胡索酸及草酰乙酸的生成减少，尿素循环受到抑制，产生的鸟氨酸不能被机体转化为精氨酸；另一方面还使谷胱甘肽还原酶的含量显著性降低[9]，进而影响了谷胱甘肽的的生成，甘氨酸是合成谷胱甘肽的主要原料之一。甘氨酸和精氨酸的减少，继而使胍基乙酸水平降低。
可的松是大鼠体内自发产生的糖皮质激素，它本身是无效的，但经肝脏可被转换成活性代谢产物氢化可的松。氢化可的松过度可造成血清中抗氧化剂GSH含量下降，肝脏抗氧化酶SOD活性降低，MDA含量升高。文献报道[10]，氢化可的松可致小鼠肝索排列紊乱，细胞间无明显的分界，肝窦淤血等肝组织病变，提示，氢化可的松对肝组织有较强的损害作用。模型组血清中可的松水平与正常空白组相比，其含量上升，使体内氢化可的松的含量超过正常水平，激素水平紊乱。
泛醌是一种黄色脂溶性醌类化合物，存在于多数真核细胞中，尤其是线粒体。其在线粒体内膜上的含量远远高于呼吸链其他组分的含量，而且脂溶性使它在内膜上具有高度的流动性，它是呼吸链中唯一不与蛋白质结合的电子载体。在模型组中，泛醌的水平升高，说明电子传递受到干扰，使呼吸链功能异常，影响ATP的合成，继而氧化磷酸化和三羧酸循环代谢的紊乱。另有文献报道，YAO等[1112]利用人类肝细胞L02研究雷公藤甲素的细胞毒性作用时，发现其与线粒体膜电位有关。提示我们雷公藤致肝损伤的机制可能与肝细胞线粒体中的呼吸链电子的传递相关。
3吲哚丙酸，主要在哺乳动物和鸟类消化道的共生细菌中，由色氨酸脱氨产生。模型组血清中3吲哚丙酸的减少，提示，色氨酸的代谢受到抑制或中断，氨基酸代谢紊乱。同时3吲哚丙酸能够抑制氧化应激反应，能够清除自由基，防止自由基攻击生命大分子造成组织细胞损伤，延缓机体的衰老，和其他神经系统疾病。提示，高剂量组血清中3吲哚丙酸的下降，可能与雷公藤多苷致肝毒性的脂质过氧化反应有关。
色氨酸是体内重要的神经递质5羟色胺的前体代谢物，可通过5羟色胺调节动物采食量，使大脑活动受到暂时抑制，使动物趋于安静；同时有利于降低动物维持需要，促进其生长和提高饲料转化效率。实验中，雷公藤致肝毒性高剂量组血清中色氨酸减少，减少了大鼠的采食量，此与实验中观察到的大鼠生长生活行为现象较一致。
色氨酸是人体必需的8种氨基酸之一，在体内大部分用于蛋白质的合成，约1%～2%用于合成5羟色胺（5HT），其余在肝脏经犬尿氨酸代谢途径代谢，因而肝功能障碍可明显影响色氨酸在体内的代谢状态。本实验中雷公藤致肝损害高剂量组血清中色氨酸的下降与文献[13]中肝肿瘤、肝衰竭病人血清的结果较一致。表明雷公藤使肝功能异常，从而严重影响了色氨酸的代谢。
另文献报道，雷公藤中的萜类、生物碱类成分在体内主要表现为免疫抑制剂，可激发肝内免疫应答，引起免疫介导性肝毒性[14]。雷公藤引起脂质过氧化后的，坏死的肝细胞可激活其巨噬细胞，导致TNFα合成和分泌，进一步加重肝肾组织的损伤；同时可上调肝细胞、肾小管上皮细胞中的Fas表达，可能通过Fas的途径诱导肝、肾细胞的凋亡从而导致肝、肾损伤。以上过程可能会引起免疫系统调节剂5羟色胺和免疫抑制剂氢化可的松的代谢水平的变化，同时引起色氨酸和可的松代谢水平的变化，进而使造成体内氨基酸代谢、激素代谢等途径的紊乱。
6磷酸葡萄糖胺是进入细胞内的葡萄糖在糖酵解的过程中，少量的葡萄糖由6磷酸葡萄糖转变为6磷酸果糖后，在6磷酸果糖转氨酶（GFAT）催化下，以谷氨酰胺提供氨基而生成。高剂量组中6磷酸葡萄糖胺含量的减少，可能是由于细胞内葡萄糖的浓度较低，糖酵解活性作用增强。提示雷公藤致肝损伤可能与糖酵解途径的紊乱相关。
溶血磷脂是磷脂的降解产物，一般最常用的磷脂类化合物是卵磷脂，因而溶血磷脂通常是指溶血卵磷脂，或称溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidyl choline，LPC）。肝功能损害时，肝脏脂蛋白合成发生障碍，是由于脂蛋白合成的重要原料磷脂酰胆碱（卵磷脂）的供应不足[15]，进而生成溶血磷脂减少，不利于肝脂肪的运出，可出现脂肪病变。此与本文前面所描述的模型组中肝组织病理特点较吻合。同时汤靓[16]通过比对DEN诱导大鼠肝癌模型与人肝癌患者的代谢组学数据，以及丁黎莉[17]对99例肝硬化、肝癌患者和30例正常血清研究发现，血浆中溶血磷脂酰胆碱代水平异常，其含量的变化与体内磷脂的代谢相关，影响了脂类代谢。模型组血清中溶血磷脂酰胆碱的减少，提示雷公藤可使磷脂代谢受到抑制或中断，脂类代谢紊乱。
总之，本研究应用代谢组学方法对给药组大鼠内源性代谢产物与对照组大鼠内源性代谢物之间的差异进行研究，经比较分析，共得到7个差异代谢物，为阐明雷公藤致肝损伤的复杂机制提供了参考，也为雷公藤致肝损伤的早期筛查与诊断提供了思路。
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[责任编辑孔晶晶]