[摘要] 目的 通过观察肺栓塞大鼠肺动脉干、外周血中血管紧张素转化酶Ⅱ（ACE2）在栓塞发生后不同时间点的表达情况，分析其在肺动脉血管重构中的作用。 方法 将雄性SD清洁级大鼠120只按随机数字表法分为对照组、假手术和栓塞组，每组各40只。栓塞组大鼠再随机分为5个亚组，即栓塞24 h组、栓塞1周组、栓塞2周组、栓塞4周组和栓塞8周组。在相应的时间点进行肺动脉干、外周血中的ACE2含量检测及肺动脉干的病理检查。 结果 与对照组比较，假手术组大鼠肺动脉干、外周血中的ACE2的表达差异无统计学意义（P > 0.05）；栓塞组大鼠在栓塞1、2、4、8周后肺动脉干、外周血中的ACE2的表达均显著降低（P < 0.05）。病理切片结果显示，栓塞组大鼠的肺动脉干出现明显的炎症细胞浸润、肺纤维化现象，并发生以肉芽组织增生为表现的血管重构现象。 结论 肺栓塞大鼠ACE2的表达明显降低；ACE2表达水平降低可能加重肺动脉血管重构。
[关键词] 肺栓塞；血管紧张素转化酶Ⅱ；血管重构；大鼠
[中图分类号] R563 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）11（b）-0004-04
[Abstract] Objective To measure angiotensin-converting enzyme 2 （ACE2） concentrations in peripheral blood and pulmonary artery trunk at different time points during the pulmonary embolism in rats， in order to investigate the effects of ACE2 on pulmonary vascular remodeling. Methods 120 male rats were randomly divided into pulmonary embolism group， control group and sham surgury group by random number table， with 40 rats in each group. Then， according to the different time points after embolization， the rats in pulmonary embolism group were further divided into 5 subgroups： embolization 24 h group， embolization 1 week group， embolization 2 weeks group， embolization 4 weeks group and embolization 8 weeks group. Concentrations of ACE2 both in pulmonary artery trunk and peripheral blood were measured at the corresponding time point， as well as the pathological examinations of pulmonary artery trunks. Results Compared with control group， the concentrations of ACE2 in the pulmonary trunk and peripheral blood of the sham operation group were not statistically significant （P > 0.05）. While the concentrations of ACE2 in pulmonary embolism group were significantly lower than those in control group at 1 week， 2 weeks， 4 weeks and 8 weeks after embolization （P < 0.01）. Meanwhile， pathological examination results showed clearly the infiltration of inflammatory cells around pulmonary artery trunk， pulmonary fibrosis and vascular remodeling with a hyperplasia of granulation tissue. Conclusion The expression of ACE2 reduced significantly in pulmonary embolism rat model， and the low concentrations of ACE2 may aggravate pulmonary vascular remodeling.
[Key words] Pulmonary embolism； Angiotensin converting enzyme 2； Vascular remodeling； Rat
肺血栓栓塞癥（pulmonary thromboembolism，PTE）是来自静脉系统或右心的血栓阻塞肺动脉或其分支所致疾病，其以肺循环（含右心）和呼吸功能障碍为主要临床表现和病理生理特征，也是最常见的肺栓塞类型[1]。全球流行病学资料显示其发病率在千分之一以上，每年患病人数约60万[2]。在我国，PTE也是常见的心血管系统疾病之一[3]。
PTE的病理生理学变化复杂多变，栓塞发生后，由于肺血管内皮受损，释放出内皮素、血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）、二磷酸腺苷、组织胺、5-羟色胺、多种前列腺素等血管收缩性物质，使肺血管收缩，呼吸循环功能障碍，从而产生一系列心肺功能异常。急性PTE即使进行抗凝治疗1年后，仍有半数患者存在残留血栓。据报道，PTE发生1～4周内未溶、残留的栓子与肺动脉壁黏为一体，产生血管组织炎性反应，并逐渐转化为含有内皮细胞、平滑肌细胞的结缔组织，迁移到动脉内膜，可引起以肺动脉内膜纤维化为主要表现的血管重构[4-5]。这种血管重构造成血管腔狭窄、堵塞，导致栓塞部位通气、血流灌注障碍，引起以右心衰竭、低氧血症及低碳酸血症等为主的机体一系列病理生理变化，严重的可危及生命。针对这种血管重构的机制，已有研究表明神经-体液因素和循环内分泌激素起了十分重要的作用，其中肾素-血管紧张素系统（RAS）这一经典的循环酶通路是体内重要的体液调节系统之一。
AngⅡ是RAS的重要代谢产物。Ang Ⅱ作为极强的缩血管物质，能被血管紧张素转化酶Ⅱ（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）水解生成血管紧张素-（1-7）[angiotensin-（1-7），ANG-（1-7）]，而ANG-（1-7）对肾素-血管紧张素系统具有负调控的作用。本研究借助肺栓塞动物模型，通过观察肺栓塞后不同时间点大鼠肺动脉干、外周血中的ACE2的表达情况，分析其对大鼠肺动脉血管重构的影响，为PTE的预防及临床诊疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
选取3～4周龄雄性SD清洁级大鼠120只，由福建医科大学实验动物中心提供，生产许可证号为SCXK（闽）2016-0002，合格证号为0002678），体重（230±20）g。实验大鼠饲养于12 h光照/12 h黑暗的SPF级环境中，自由摄食和饮水，动物适应1周后进行实验。
1.2 试剂
兔ACE2多克隆抗体由Abcam公司提供；免疫组化检测试剂：DAB染色液由珠海市泉辉企业有限公司提供，抗体稀释液由基因科技（上海）股份有限公司提供；大鼠ACE2检测的ELISA试剂盒由上海美旋生物技术有限公司提供。
1.3 方法
1.3.1 大鼠肺栓塞模型的建立 将120只大鼠按随机数字表法分为对照组、假手术和栓塞组，每组各40只。栓塞组又根据栓塞时间不同分为24 h、1周、2周、4周和8周5组，每组8只动物。用2%的戊巴比妥钠按照0.5 mL/100 g体重的剂量进行腹腔注射，麻醉大鼠后在无菌条件下分离左侧颈外静脉，并按1 mL/kg体重静脉推注无菌生理盐水条件下制成的2.5 g/L的明胶海绵溶液，建立肺栓塞模型[6]。假手术组大鼠颈静脉注入同等体积的生理盐水后也同样结扎颈外静脉近端，缝合皮下组织、皮肤后，放回饲养笼内饲养。
1.3.2 动物标本采集 分别在造模后24 h、1 周、2周、4周、8周取动物外周血，离心获血清进行ACE2含量检测。同时，在上述不同时间点获取大鼠的左肺动脉干，经4%多聚甲醛固定，进行HE染色及相关免疫组化检测。
1.3.3 血清ACE2含量检测 利用ELISA法测定清ACE2含量。向预先已包被大鼠血清ACE2捕获抗体的微孔中，依次加入待测血清标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过适当的温浴及洗涤，利用底物TMB（TMB在过氧化物酶的催化下转为蓝色，在酸的作用下转成最终黄色）在450 nm的吸光度值，进行ACE2浓度的测定。
1.3.4 大鼠肺动脉干ACE2免疫组化检测 首先将标本石蜡切片在68℃条件下烘烤脱蜡至水化后，将玻片放置装有已沸腾柠檬酸抗原修复液的压力锅中25 min；自然冷却后用0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗2次；3%过氧化氢孵育5 min以灭活内源性过氧化物酶，再用PBS清洗2次；加入ACE2兔多克隆抗体（1∶100），4℃过夜孵育，然后PBS清洗2次；滴加二抗，室温孵育30 min后，PBS清洗2次；最后进行DAB显色；纯化水充分冲洗，苏木精复染，酒精分色，PBS复色，酒精梯度脱水，二甲苯透明，树胶封片。与此同时，用PBS分别代替一抗、二抗作为阴性对照。
采用Bresalier等[7]的半定量公式判断染色结果。每张切片在400倍视野下随机选取10个视野，根据细胞染色强度分为4级，并分别计分如下：细胞无着色（0）；细胞着色为浅黄色（1）；细胞着色为棕黄色（2）；细胞着色为棕褐色（3）。同一视野根据染色为浅黄色以上细胞的面积占视野面积的比例计分：0%～<30%为0分；30%～<50%为1分；50%～<80%为2分，≥80%为3分；将同一视野两项计分相加为该视野的积分。将10个视野的积分代入下列计算公式计算每张切片的平均染色强度：IS=∑{（0×F0）+（1×F1）+（2×F2）+（3×F3）+（4×F4）+（5×F4）+（6×F6）}，F=n/l0（n=0、1、2、3、4、5、6各分值的视野数）。采用双人双盲阅片方式，重复2次，分别计算IS值，取其平均值作为最终结果。
1.3.5 肺动脉干形态学分析 采用常规苏木精-伊红染色，通过电子显微镜观察血栓、内皮细胞、水肿、炎症细胞、纤维蛋白、纤维母细胞、肉芽组织等情况。图像分析是采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行分析。
1.4 统计学方法
数据采用GB-STAT统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组外周血ACE2浓度比较
在整个实验观察期间，对照组和假手术组同一时间点的外周血ACE2浓度比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。相比之下，栓塞组1、2、4周外周血ACE2浓度极显著低于对照组（P < 0.01）；与栓塞24 h比较，栓塞组8周外周血ACE2浓度略有回升（P < 0.05），但仍显著低于同时间点的对照组外周血ACE2浓度（P < 0.05）。见表1。
2.2 各组肺动脉干ACE2表达免疫组化结果
在整个实验观察期间，对照组和假手术组栓塞后同一时间点肺动脉干ACE2表达比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）；栓塞組栓塞后各时间点肺动脉干ACE2的表达均显著低于同期对照组，差异有统计学意义（P < 0.01）。栓塞24 h后，栓塞组ACE2表达开始下降，第2周最低，从第4周后开始逐渐升高（P < 0.05）。见表2、图1，封四。
2.3 各组大鼠肺动脉干血管病理切片结果
病理切片结果显示：对照组、假手术组大鼠的肺动脉干的血管内膜光滑，内皮细胞未见水肿变性及脱落（图2A、2B，封四）。栓塞组大鼠在各时间点均出现不同程度的肺动脉干血管的重构现象：急性栓塞期内出现肺动脉干血管内皮细胞水肿变性、纤维蛋白渗出、炎症细胞浸润、附壁血栓形成等（图2C、2D、2E，封四）。慢性期逐渐出现肉芽组织形成、纤维母细胞增生、血管壁黏液及玻璃样变性、血栓表面上皮细胞再生伴有机化等（图2F、2G，封四）。
3 讨论
PTE是一種多因素参与、多个功能系统间平衡失调所致的疾病，其发生不仅与血液中凝血、抗凝、纤维蛋白溶解系统，以及以血管、血细胞构成的凝血、抗凝血平衡异常相关，甚至与炎性因子相关。已有研究表明：在PTE的血管重构中，Ang Ⅱ是一个重要介质[8-9]。Ang Ⅱ通过与Ang Ⅱ 1型受体（angiotensin 1 receptor，AT1R）结合，发挥血管收缩、纤维化、血管内皮细胞凋亡、氧化应激和炎性反应等一系列病理生理效应[10-12]。
ACE2是血管紧张素转化酶（angiotensin convertion enzyme，ACE）的同系化合物[13-14]，主要功能是水解Ang Ⅱ，生成Ang-（1-7）[15]，而Ang-（1-7）是肾素-血管紧张素系统中的血管保护肽[16-18]，与G蛋白偶联受体Mas原癌基因受体结合，发挥与Ang Ⅱ相反的生物学效应，包括扩张血管、抗肥大、抑制凋亡、抗炎性反应等，从而起到减轻肺损伤、改善病理性血管重构的作用[19-20]。ACE2-Ang-（1-7）-Mas 受体轴对肺脏的这种保护作用，一方面是通过ACE2 降解Ang Ⅱ，减少缩血管作用，另一方面Ang-（1-7）本身具有促进Ang Ⅱ2 型受体的激活及血管Ang Ⅱ1 型受体的部分抑制作用，对改善血管内皮功能，释放舒张血管物质如缓激肽、前列腺素和NO，以及对炎性细胞的趋化募集、炎性因子的释放起负向调节作用等有关[21]。
本实验研究中，在大鼠肺栓塞发生后，其外周血、肺动脉中的ACE2表达量均明显降低。由于栓塞时间的不同，ACE2表达水平较高的大鼠，其肺动脉血管重构程度、进展均明显低于ACE2表达水平较低的肺栓塞大鼠。本研究结果提示，ACE2参与了大鼠血管重构调节的过程，并对血管重构起抑制作用。同时，该调节作用可能通过ACE2-Ang-（1-7）-Mas轴抑制了AngⅡ诱导的病理生理效应[22]，从而达到保护血管内皮功能、改善血管重塑现象。
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