扶正散结方调控Lewis肺癌小鼠TAMs免疫重塑作用的相关研究

打开文本图片集

[摘要]目的：探讨扶正散结方对Lewis肺癌小鼠肿瘤相关巨噬细胞有关细胞因子的调控作用。方法：建立Lewis肺癌小鼠模型，称瘤重，算抑瘤率;应用免疫组化法检测各组肿瘤组织中CD68^/1浸润程度;采用ELISA法测定小鼠血清中IFN-γ，TGF-β，IL-4，IL-13，IL-6，IL-10，IL-12，TNF-_α的含量。结果：与荷瘤模型组相比，其他各组均较高，分别为DDP组（50.28%）、中药预防组（34.37%）、中西结合组（66.76%），差异具有统计学意义（P<0.05）。CD68^/1浸润程度差异不具统计学意义。各组荷瘤小鼠血清中IFN-γ，IL-6，IL-12含量均较空白对照组低，而IL-4，IL-13，TGF-β含量均较空白对照组高，且在不同药物干预下，部分相关细胞因子含量具有显著性差异（P<0.05），中药预防组、中西医结合组与荷瘤对照组差异亦具有统计学意义（P<0.05），而TNF-_α，IL-10含量，与荷瘤对照组比较，不具统计学意义。结论：扶正散结方可以通过下调肺癌免疫微环境中IL-4，IL-13，TGF-β等，上调IFN-γ等细胞因子，从而逆转TAMs的免疫重塑作用，控制肿瘤生长。

[关键词]中医药;Lewis肺癌;TAMs免疫重塑

RelevantstudiesoneffectofFuzhengSanjierecipeiegulatingimmune

microenvironmentremodelingofTAMsinlewislungcancermice

LIJin-hua^/1，TIANFei2*，QIUChong-sheng1，CHENWen-jun^/1，XUDong-xin^/1，YANGLi-qin^/1，LIRui-jie^/1

（1.TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine，Tianjin300193，China;

2.TheFirstAffiliatedHospitalofTianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine，Tianjin300193，China）

[Abstract]Objective：TostudytheeffectofFuzhengSanjierecipeiegulatingtumor-associatedmacrophages（TAMs）inLewislungcancermice.Method：EffortsweremadetoestablishtheLewislungcancermousemodel，weightumorsandcalculatetheanti-tumorrate.TheimmunohistochemicalmethodwasusedtoexaminetheinfiltrationdegreeofCD68^/1intumortissuesineachgroup.ELISAwasusedtoexaminethecontentofIFN-γ，TGF-β，IL-4，IL-13，IL-6，IL-10，IL-12，TNF-_αinmiceserum.Result：Comparedwiththetumor-bearingmodelgroup，alloftheothergroupsshowedhighertumorinhibitioates，i.e.50.28%fortheDDPgroup，34.37%fortheTCM-preventinggroupand66.76%fortheChineseandwesternmedicinegroup，withstatisticaldifference（P<0.05），butwithoutstatisticaldifferenceintheinfiltrationdegreeofCD68^/1.TheexpressionsoftheIFN-γ，IL-6，IL-12intumor-bearinggroupswerelowerthanthatintheblankcontrolgroup，butwithhighercontentsofIL-4，IL-13，TGF-β.Intervenedwithdifferentdrugs，thereweresignificantdifferencesincontentamongsomerelevantcytokines（P<0.05），aswellasstatisticaldifferencesamongtheTCMpreventiongroup，theChineseandwesternmedicinegroupandthetumor-bearingcontrolgroup（P<0.05），butwithoutstatisticaldifferenceinTNF-_αandIL-10contentfromthetumor-bearingcontrolgroup（P<0.05）.Conclusion：FuzhengSanjierecipecouldreversetheimmuneremodelingeffectandcontrolthetumorgrowthbydown-regulatingtheexpressionsofIL-4，IL-13，TGF-βinlungcancerimmunemicroenvironmentandup-regulatingtheexpressionofIFN-γ.

[Keywords]traditionalChinesemedicine;Lewislungcancer;immunemicroenvironmentremodelingofTAMs

doi：10.4268/cjcmm20150633

侵袭和转移是造成肺癌患者治疗失败和死亡的主要原因，近年来，越来越多的学者认识到^[1-2]，免疫逃逸机制是肺癌侵袭和转移的关键所在，而肿瘤相关巨噬细胞（tumor-assosoatedmicrophages，TAMs）的免疫重塑功能起着重要作用。在抗肿瘤免疫中，巨噬细胞可作为抗原提呈细胞，也可以作为直接的效应细胞，从而抑制和杀伤肿瘤。但是，巨噬细胞有着很强的可塑性，在不同环境的影响下，巨噬细胞可以产生M1和M22种不极化类型^[3]。M1型巨噬细胞由经典活化途径产生，能激活机体特异性免疫应答，并能有效清除肿瘤细胞和入侵的病原体。而M2型巨噬细胞通过替代激活途径产生，这种类型的巨噬细胞非但没有抗肿瘤作用，还能促进肿瘤的侵袭和转移。在肿瘤微环境中，外周血单核细胞浸润到肿瘤组织，在肿瘤细胞及其微环境的刺激下分化成为TAMs，而TAMs更倾向于M2极化类型的免疫抑制表型，这就是TAMs的免疫重塑。因此，逆转TAMs的免疫重塑作用成为了干预肺癌侵袭转移的又一途径。本研究，通过观察扶正散结方对Lewis肺癌模型小鼠抑瘤率、肺转移率、肺癌组织中TAMs数量及外周血中相关细胞因子水平的影响，从逆转TAMs免疫重塑作用角度探讨扶正散结方与肺癌侵袭转移的关系。

1材料与方法

1.1动物与瘤株实验动物用SPF级C57BL/6J小鼠75只，均为雄性，6～8周龄，体重18～22g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。合格证号SCXK（军）2007-004。Lewis肺癌瘤株购自天津市医药科学研究所。

1.2药物扶正散结方：主要成分为生黄芪、当归、冬虫夏草、白花蛇舌草、龟板、鳖甲。处方药材均购自天津市医药公司，经天津中医药大学张建岭教授鉴定，符合《中国药典》2010年版标准。黄芪为豆科植物膜荚黄芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.的根;当归为伞形科植物当归Angelicasinensis（Oliv.）Diels的干燥根;冬虫夏草为麦角菌科植物冬虫夏草Cordycepssinensis（Berk.）Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫的尸体;白花蛇舌草为茜草科植物白花蛇舌草Oldenlandiadiffusa（Willd.）的全草;龟板为龟科动物乌龟Chinemysreevesii（Gray）的腹甲及背甲;鳖甲为鳖科动物鳖Trionyxwiegmann的背甲。

扶正散结方制剂制备：药物按照固定比例称取，碾碎，用95%乙醇浸泡48h，取出晾干后放入电热恒温干燥箱，60℃烤干12h，粉碎机粉碎，过60目筛网，得干燥药物粉末。取粉末状药材用8倍量蒸馏水进行热回流提取2次，每次5h，过滤，药渣再用95%乙醇进行热回流提取2h，自然冷却后，倒出乙醇水溶液，过滤药渣，与水提物合并进行真空减压浓缩干燥得到制备样品，并制备成合剂，浓缩为2g·mL-1，于4℃冰箱贮存备用。

顺铂（DDP），锦州九泰药业有限公司产品，批号H21030242，溶于200mL生理盐水中，制成0.5g·L-1溶液，避光。

1.3造模取对数生长期的Lewis肺癌细胞，无菌条件下，200目滤网过滤，制成单细胞悬液，生理盐水将悬液稀释6×10^/1个/mL细胞悬液，取0.1mL原液常规方法接种于除空白对照组外的各组小鼠右前肢腋下。

1.4分组及给药^[4]将75只Lewis肺癌小鼠接瘤，第5天观察到成功造模后，按照随机数字分为5组：空白对照组（非荷瘤组）、荷瘤对照组、顺铂组（DDP组）、中药预防组、中西结合组（中药+DDP组），每组15只。第6天开始药物干预，给药剂量和方法如下，空白对照组：生理盐水0.4mL灌胃，qd，连续2周;荷瘤对照组：生理盐水0.4mL灌胃，qd，连续2周;DDP组：给予DDP溶液0.2mL（5mg·kg-1）一次性腹腔注射，3次/周，连续2周;中药预防组：在接种前5d按扶正散结方药0.4mL（2g·mL-1）灌胃，qd，连续2周;中西结合组：予扶正散结方药0.4mL（2g·mL-1）灌胃，qd，连续2周，同时予DDP溶液0.2mL（5mg·kg-1）一次性腹腔注射，每周3次，连续2周。小鼠的中药给药剂量按“人和动物间体表面积折算的等效剂量比率表”计算得出。DDP的给药剂量按相当于人1/10LD50剂量并按“人和动物间体表面积折算的等效剂量比率表”折合后剂量给药。

1.5小鼠生存状态每日观察各组小鼠体态、毛色、进食及死亡等情况。

1.6测取瘤体的大小药物干预期间（第6天开始），游标卡尺隔日测量荷瘤小鼠腋下肿瘤的短径、长径，记录并计算瘤体体积。肿瘤体积=（短径^/1×长径）/2。

1.7瘤重及抑瘤率的测定末次给药24h后，自小鼠腹主动脉中采外周血备用，后脱颈椎处死小鼠，迅速剥取各组荷瘤腋下肿瘤组织标本，电子天平称取瘤体的质量，计算抑瘤率。并取1.5cm×1cm×0.5cm生长良好瘤组织，10%多聚甲醛中固定，其余瘤组织生理盐水中保存，并取空白对照组小鼠腋下与瘤块大小相近的正常组织，生理盐水中保存。肿瘤抑制率=（1-药物干预组肿瘤平均质量/荷瘤对照组肿瘤平均质量）×100%。

1.8肿瘤组织中各型巨噬细胞的测定免疫组化法检测各组肿瘤组织中CD68^/1巨噬细胞浸润程度，流式细胞仪检测瘤组织中M1型（F4/80^/1CD86^/1）和M2型（F4/80+CD206^/1）巨噬细胞的浸润情况。

1.9外周血中各类相关因子的测定小鼠血清制备^[3]：自小鼠腹主动脉采取外周血后，置离心机中以3000r·min-1速度离心15min，取上层血清于3mL离心管内，保存-70℃冰箱中。采用双抗体夹心ELISA法，按试剂盒说明书步骤进行，测定小鼠血清中IFN-γ，TGF-β，IL-4，IL-13，IL-6，IL-10，IL-12，TNF-_α的含量。

1.10统计学方法所有实验数据采用SPSS17.0统计学软件进行统计处理，计量资料以±s表示，经检验各组数据均具有方差齐性，统计学方法采用单因素方差分析及t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组小鼠生存状态观察接种后第5天，除空白对照组（非荷瘤组）外，其余各组小鼠右前肢腋下均可触及约黄豆大小瘤块，接种后第7天各组荷瘤小鼠瘤体生长明显加快，均逐渐出现毛发脱落且无光泽、聚集、不活泼、行动迟缓和进食量减少等现象。空白对照组一般情况未见明显异常，中药预防组一般情况较好，荷瘤模型组及中西结合组一般情况较差，DDP组一般情况最差。分别于第10，12天时DDP组小鼠因进食减少等化疗后毒副反应而死亡共2只。

2.2各组荷瘤小鼠肿瘤生长情况第6天时测量的荷瘤对照组、DDP组、中西结合组各组荷瘤小鼠肿瘤生长情况基本一致，而中药预防组荷瘤小鼠肿瘤相对较小，但同日测量的小鼠肿瘤体积比较无统计学意义。荷瘤对照组小鼠在实验后期肿瘤体积呈持续性增长，生长加快，生长曲线陡直，各药物干预组小鼠在肺癌模型建立第14天后可观察到的肿瘤生长趋势逐渐减缓（表1）。

2.3各组荷瘤小鼠瘤重和抑瘤率的比较DDP组、中药预防组、中西结合组均有抑瘤作用，且各组平均瘤重比较：荷瘤对照组>中药预防组>DDP组>中西结合组，抑瘤率则相反，且中西结合组的抑瘤率明显优于其他组（P<0.05）（表2）。

2.4组织中各型巨噬细胞浸润程度的测定免疫组化结果表明，荷瘤对照组肿瘤组织中CD68^/1巨噬细胞浸润程度最高（），中药预防组的浸润程度有所减轻（），DDP组和中西结合组的浸润程度较前2组明显减轻（+），空白对照组几乎未见巨噬细胞浸润情况，说明扶正散结方药能在一定程度上预防、减少巨噬细胞在肿瘤组织中浸润，而化疗药物的使用，能有效控制肿瘤的进展。

流式细胞术结果显示，M1型巨噬细胞（F4/80+CD86^/1）含量比较：中西结合组>DDP组>中药预防组>荷瘤对照组，统计学上并未见明显差异;M2型巨噬细胞（F4/80+CD206^/1）含量比较：荷瘤对照组>中药预防组>DDP组>中西结合组，统计学上并未见明显差异。

2.5小鼠血清中IFN-γ，TGF-β，IL-4，IL-13，IL-6，IL-10，IL-12，TNF-_α等相关因子的测定各组荷瘤小鼠血清中IFN-γ，IL-6，IL-12，TNF-_α含量均较空白对照组低，各组荷瘤小鼠血清中IL-4，IL-13，TGF-β，IL-10含量均较空白对照组高，且在不同药物干预下，部分相关细胞因子含量具有显著性差异，差异具有统计学意义（P<0.05），但IL-10，TNF-_α在中药预防组、中西结合组中含量与荷瘤对照组相比，不具统计学意义（表3）。

3讨论

免疫监视学说认为，机体的免疫系统可以发挥免疫监视作用，识别并消灭任何表达新抗原的“异己”成分或突变细胞，以保持机体内环境的稳定。当机体免疫监视功能低下，无法有效清除异己成分和突变细胞时，就可能发生肿瘤^[1-2]。而免疫抑制性细胞是造成免疫监视功能降低的重要因素，肿瘤相关性巨噬细胞（TAMs）的免疫重塑作用使其成为免疫抑制性细胞的代表。M1型和M2型是2种常见的巨噬细胞活化类型，研究显示，正常组织中浸润的巨噬细胞主要为M1型，而肿瘤组织则逐渐转化为M2型^[5]。这2种表型细胞分化过程如下^[5]：M1型巨噬细胞主要由IFN-γ等诱导产生，细胞表面分子B7（CD86）表达上调，主要分泌IL-6，IL-12，TNF-_α等细胞因子以杀伤细菌和肿瘤细胞;而M2型则由IL-4，IL-13，TGF-β等因子诱导分化而成，细胞表面甘露糖受体（CD206）表达上调，分泌IL-10等细胞因子以抑制免疫应答、促进伤口愈合、促进血管生成而促进肿瘤的进展。

关于肿瘤的发生机制，中医学强调的是“正虚邪实”^[4]，肿瘤发病的基础在于内虚，正虚贯穿于肿瘤发生、发展的始终^[6]。中医药对于恶性肿瘤的发生发展有着良好的治疗效果，其治疗的关键点主要围绕着“整体观念”的思想进行。中医认为“养正积自消”，肿瘤的发生与发展，其实是正（宿主）与邪（肿瘤）相争的过程，也是机体内环境诸多阴阳平衡被打破的恶性循环的过程。肿瘤患者的体质为“瘤部为实，整体为虚”，本虚标实，提倡整体调节和辨证论治，“扶正祛邪”是为了达到“阴平阳秘，精神乃治”，恢复机体正常的微环境的“稳态”的目的^[7-8]。

扶正散结方^[3]君以黄芪补气健脾、益卫固表;臣以当归补血活血，冬虫夏草补肾益肺，可达益气扶正，生血养血之功;佐以白花蛇舌草清热解毒，使以鳖甲、龟板善治开阖失常之病，均具有很好养阴补肾作用，用于肿瘤，寓攻于补，可收补益、消瘤双重效果。全方配伍共奏扶正不留邪，攻邪不伤正之功。前期研究表明^[5]，本方可改善小鼠生存质量，增加胸腺重和胸腺指数，提高免疫功能，上调血清IFN-γ含量，下调IL-4的含量，逆转肿瘤发生时Th1/Th2向Th2漂移即肿瘤发生时的免疫抑制状态。本实验表明：各组荷瘤小鼠生存状态比较，中药预防组出现毛脱落无光泽、聚集、不活泼、行动迟缓和进食量减少的现象较其他组明显较少;同荷瘤对照组抑瘤作用比较，各组对移植瘤均有抑制作用，且中西结合组抑瘤作用明显优于其他各组，由此可再次证明，本方可明显改善荷瘤小鼠的生活状态，并对化疗药具有协同增敏作用;中药预防组和中西结合组中IL-4，IL-13和TGF-β含量较荷瘤对照组明显减少，而IFN-γ，IL-6和IL-12的含量则中药预防组和中西结合组比荷瘤对照组相对较高，具有统计学意义，但是F4/80+CD86^/1，F4/80+CD206^/1，IL-10，TNF-_α在各组荷瘤小鼠中的平均含量其差异性不具统计学意义，究其原因，可能是因为M1，M2型只是巨噬细胞2个常见的极化类型，尚存在着过渡类型，以后应对过渡类型及其分泌的细胞因子进行检测。

综上所述，扶正散结方可能通过下调肺癌免疫微环境中IL-4，IL-13，TGF-β等与诱导M2型巨噬细胞分化成熟相关的细胞因子的表达，上调IFN-γ等与M1巨噬细胞分化成熟相关的细胞因子，从而逆转TAMs的免疫重塑作用，控制肿瘤生长和防止扩散转移。提示在临床工作中，对肺癌患者可辨证选用扶正散结方以改善患者免疫功能，控制病情进展，提高生活质量。

[参考文献]

[1]MantovaniA，RomeroP，KarolinaPaluckaAK，etal.Tumourimmunity：effectorresponsetotumourandroleofthemicroenvironment[J].Lancet，2008，371（9614）：771.

[2]WangHY，WangRF.RegulatoryTcellsandcancer[J].CurrOpinImmunol，2007，19（2）：217.

[3]马薇.不同活化亚型的巨噬细胞在非小细胞肺癌免疫逃逸中的作用初探[D].南宁：广西医科大学，2011.

[4]郭冬梅，田菲，陈立伟，等.扶正散结方逆转Lewis肺癌小鼠Th1/Th2漂移相关性研究[J].四川中医，2012（9）：39.

[5]黎磊.扶正解毒方对小鼠前胃癌所诱导的肿瘤相关巨噬细胞干预作用研究[D].北京：北京中医药大学，2013.

[6]周岱翰.中医肿瘤学[M].北京：中国中医药出版社，2011.

[7]李尧，钱文慧，陆茵，等.中医治则治法与肿瘤微环境[J].中医杂志，2011（21）：1801.

[8]芦殿荣，芦殿香，冯利.中药治疗恶性肿瘤骨转移疼痛临床应用概述[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（2）：251.

[责任编辑张宁宁]