[摘要] 目的 觀察高氧暴露对新生小鼠肺部炎性反应及纤维化的影响。 方法 新生2日龄昆明小鼠40只，随机分为空气组（n = 20）及高氧组（n = 20），分别在空气或（60±5）%氧气中饲养。每天检测小鼠状态，隔天记录小鼠体重情况。在实验第3、7、14、21天，每组各取5只小鼠处死，观察肺组织外观、计算肺组织湿/干重比值；HE染色观察肺组织病理结构；天狼星红染色观察肺组织胶原纤维情况。 结果 ①实验过程中两组均未出现小鼠死亡；高氧组小鼠高氧暴露后第7天开始体重明显低于空气组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。②高氧暴露后第7天开始，小鼠肺湿重/干重比值均高于空气组，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。③高氧组肺部结构随高氧暴露时间的增加逐渐出现典型支气管肺发育不良（BPD）样表现：肺泡呈不规则结构，腔隙较大，部分肺泡融合，整体数量减少，部分区域有炎性不张；高氧暴露后第14、21天，高氧组辐射状肺泡计数（RAC）低于空气组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。④高氧暴露后第7、14、21天，高氧组肺部胶原面积较空气组显著增加。 结论 持续高氧暴露可成功制作BPD小鼠模型；持续高氧暴露后可导致新生小鼠肺部炎性反应及纤维化增加，可能是BPD发生的重要机制。
[关键词] 支气管肺发育不良；新生小鼠；高氧暴露；炎性反应；纤维化
[中图分类号] R722.6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）09（b）-0021-04
Effects of hyperoxia on pulmonary inflammation and fibrosis in newborn mice
XU Fengdan1，2 WANG You1 WU Wenshen2 XIE Songmin2
1.Department of Pediatrics， Guangdong Medical University， Guangdong Province， Dongguan 523808， China； 2.NICU， Dongguan Eighth People"s Hospital， Guangdong Province， Dongguan 523235， China
[Abstract] Objective To observe the effects of hyperoxia exposure on pulmonary inflammatory response and fibrosis in new born mice. Methods 40 Kunming mice aged 2 days were randomly divided into air group （n = 20） and hyperoxia group （n = 20）， reared in air or （60±5）% oxygen respectively. The mice were examined daily and the weight was recorded the next day. At the 3rd， 7th， 14th， 21st day of the experiment， 5 mice of each group were sacrificed respectively， then the appearance of lung tissue， lung wet/dry weight ratio were observed； the pathological structure of lung tissue was examination by HE staining； collagen fiber of lung tissue was examination by Sirius red staining. Results ①No mouse died in the two groups during the experiment. The weight of mousein hyperoxia group was significantly was lower than that of air group at the 7th day after exposured to oxygen， the difference was statistically significant （P < 0.01）. ②The ratio of lung wet/dry weight in hyperoxia group was higher than that in air-group begin the 7th day after hyperoxia exposured， the difference was statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. ③In hyperoxia group， with the time of exposured to oxygen increasing， lung structure showed typical BPD： alveoli showed irregular structure， interstitial was large， partial alveoli fused， alveolar count decreased， partial region occured inflammatory closed； at the 14th， 21st day after hyperoxia exposured， RAC in hyperoxia group was lower than air group， the difference was statistically significant （P < 0.01）. ④Compared with air group， collagen area in hyperoxia-group increased at yhe 7th， 14th， 21st day after hyperoxia exposured. Conclusion BPD micemodels were successfully produced by sustained hyperoxia exposure. Sustained hyperoxia exposure may increase lung inflammation and fibrosis in neonatal mice， which may be an important mechanism for the development of BPD.
[Key words] Bronchopulmonary dysplasia； Newborn rats； Hyporoxia； Inflammation； Fibrosis
支气管肺发育不良（BPD），又称新生儿慢性肺病（CLD），于1976年由Northway等[1]首次提出，是早产儿常见的慢性疾病，是吸氧和机械通气治疗早产儿后最常见的并发症[2]。随着医疗水平的提高，尽管早产儿存活率增加，但BPD发病率有逐年增加的趋势，然而目前BPD的发病机制仍未完全明确，也缺乏有效防治方法[3-4]。成功建立动物BPD模型是临床研究BPD发病机制的重要基础，本文通过高氧暴露方法制作了BPD小鼠模型，并对肺组织炎性反应及纤维化情况进行了初步观察，为进一步探讨BPD发病机制及防治方法提供良好的实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物
2日龄新生昆明小鼠40只，平均体重为（2.18±0.18）g，雌雄不限，购自军事医学科学院（动物合格证号：0026757）。
1.2 仪器及试剂
自制封闭聚乙烯高氧饲养箱、医用氧气瓶及氧气（北京东方医用气体有限公司）、KY-2F型控氧仪（浙江省建德市新安江分析仪器二厂）、钠石灰（上海五四化学试剂有限公司）、全自动组织脱水机（Thermo Excelsior ES）、BMJ-Ⅲ型包埋机（常州市中威电子仪器有限公司）、组织切片机、YD-AB型生物组织摊烤片机（金华市益迪医疗设备厂）、载玻片及盖玻片（江苏世泰实验器材有限公司）、倒置显微镜（尼康E100型）。
1.3 方法
1.3.1 动物饲养及动物模型的建立 40只2日龄新生昆明小鼠，随机分组，空气组20只，高氧组20只。高氧组置于自制密封养殖箱中饲养，箱内氧浓度维持（60±5）%，底部铺垫钠石灰以吸附CO2，保持箱内温度22～26℃，湿度50%～60%，CO2浓度<0.5%。母鼠与新生小鼠共处哺乳，每日交换2组母鼠。空气组置于动物饲养房内。根据日龄增加、小鼠生长及营养状况的进展，及时分箱并随时调整饲料、饮用水添加量。在第3、7、14、21天每组各取5只小鼠处死，检测相应指标。
1.3.2 肺湿重/干重比值 小鼠处死后立即取左上肺，称取湿重。随后置于60℃烘干机中72 h，干燥后称取干重，计算湿重/干重比值。
1.3.3肺组织HE染色病理学观察 取左下肺组织，固定于4%多聚甲醛中备用，后经20%蔗糖脱水过夜。肺组织石蜡包埋后进行切片，切片厚度为4 μm，常规方法进行HE染色，将染色处理后的肺组织切片置于200倍光学显微镜下，观察病理改变。从细支气管的中心部位至最近的纤维隔或胸膜做垂直连线，对该直线上的肺泡进行计数。每个小鼠取3个切片阅读，每张切片计数5次，取平均值作为小鼠辐射状肺泡计数（RAC）。
1.3.4 肺组织天狼星红染色 肺组织石蜡切片脱蜡、蒸馏水水合，流水冲洗10 min，0.2%磷钼酸液处理1～5 min，0.1%苦味酸天狼星红染色90 min，0.01 mol/L盐酸洗2 min，70.0%酒精漂洗45 s，封片。显微镜下观察红色胶原分布情况。
1.4 统计学方法
采用统计软件SPSS 15.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况
实验过程中两组均未出现小鼠死亡现象。高氧组小鼠处理后7 d开始与对照组差异逐渐增大，表现为体重下降，毛发蓬松、光泽差，反应变差，离氧时间长则表现为少动，呼吸急促，口唇及趾端发绀，至高氧环境中则活动增多，至第21天时两组间差异更明显。空气组体重增长良好，活泼好动，毛发有光泽。两组体重变化见表1，图1～2。
2.2 肺湿重/干重比值
高氧组肺组织外观较苍白，水肿明显（图3）；从高氧处理后第7天开始，高氧组肺湿重/干重比值均高于空气组，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）（表2）。
2.3 肺组织HE染色病理学观察
2.3.1 石蜡切片HE染色 空气组肺泡间隔相对均匀，高氧组肺部结构随高氧暴露时间延长逐渐出现典型BPD样表现：早期肺泡间隔增厚，可见出血和炎性细胞浸润，后期肺泡呈不规则结构，腔隙较大，部分肺泡融合，整体数量减少，部分区域有炎性不张，提示成功建立了高氧诱导BPD模型（图4）。
2.3.2 RAC 空气组RAC随日龄逐渐增加，而高氧组RAC随高氧暴露时间延长而逐渐减少。空气组及高氧组处理后第3、7天RAC比较差异无统计学意义，高氧组处理后第14、21天低于空气组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表3。
2.4 肺组织天狼星红染色观察肺纤维化情况
高氧组胶原纤维随高氧暴露时间延长而逐渐增多，分布广泛。图像分析结果显示：第7、14、21天时高氧组胶原面积均较空气组显著增加（图5，封三）。
3 讨论
近年来，随着新生儿危重症救治水平的提高，早产儿、尤其是小早产儿存活率明显提高，然而BPD的发病率也呈现上升趋势[5]。BPD患儿病死率较高，疾病负担重[6]，存活者因心肺功能异常其生活质量差，甚至部分发生脑瘫和神经发育延迟，预后不良[7-11]。目前BPD尚无有效防治方法，因此，亟待探讨其发病机制，为临床防治BPD提供实验依据。BPD是一种多因素疾病，其确切发病机制仍未完全明确，研究显示与肺发育不成熟、高氧损伤、感染、炎性反应、纤维化及机械应力损伤等有关。新生鼠的肺发育相当于胎齡28周人肺的发育情况，因此对新生鼠肺发育的研究可为人类早产儿肺发育及肺部疾病提供研究基础[12]。BPD动物模型建立的方法很多，常用的有高氧诱导、博莱霉素肺内注射、内毒素诱导及机械通气诱导等，目前高浓度氧吸入是使用最早、最经典的制作方法[13]。研究发现，单一的高氧暴露可复制出典型的BPD病理改变[14]。目前高氧暴露的氧浓度可分为80%～100%的高浓度氧和60%～70%的中浓度氧两种，实验发现，80%～100%的高浓度氧造模时间短，但对肺损伤重，死亡率达40%，而60%～70%中浓度氧虽然造模时间较长，但死亡率低，更接近于临床实际[15]。本研究以2日龄新生小鼠为对象，饲养于（60±5）%的持续高氧环境中，结果显示能成功制作BPD的新生小鼠模型且死亡率低，为进一步探讨BPD的病理改变及发病机制提供了良好的动物模型。
肺發育成熟的重要标志是体积大、数目少的囊泡向体积小、数目多的肺泡转化。BPD患儿的尸检发现，其肺组织的主要病理改变为肺泡化障碍，从而推测BPD的病理特征为肺组织从囊泡期向肺泡期发育阻滞[16-18]。本研究结果显示，高氧组新生小鼠肺部结构随日龄增加逐渐出现典型BPD样表现：早期肺泡间隔增厚，后期肺泡呈不规则结构，腔隙较大，部分肺泡融合，整体数量减少，与空气组比较，高氧组高氧暴露后第7天RAC即明显降低，至高氧暴露后第21天差异更明显，符合BPD患儿的肺组织病理改变。肺组织中可见出血和炎症细胞浸润明显，部分区域有炎性不张，也提示高氧暴露可使炎性反应明显增加，在BPD的发生发展中可能起重要作用。本实验发现，与对照组比较，高氧组小鼠生后第7天开始体重下降明显，至第21天时两组间差异更明显，考虑与高氧组肺泡数量减少，肺间隔增厚，影响气体交换过程，提供的氧气满足不了机体生长的需求，导致机体生长发育受限。
有研究发现，肺纤维化是BPD的主要病理表现之一，而胶原沉积是肺纤维化的重要原因，故可将肺胶原检测作为衡量肺纤维化的主要标志。胶原在正常肺发育过程中可于血管壁呈现高表达，但在BPD患者肺泡壁表达则明显增加，本实验采用天狼星红染色显示肺组织纤维化情况，结果亦证实持续高氧暴露可使肺泡壁胶原明显增加，符合既往研究[19-20]结果。
综上所述，本研究通过高氧暴露成功建立了新生小鼠BPD模型，并发现炎性反应及纤维化在BPD发生发展中可能起重要作用。
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（收稿日期：2017-06-13 本文編辑：苏 畅）