【摘要】目的:建立可控性强、重复性好、简便易行的脂肪栓塞动物模型。方法:首先,将大鼠麻醉并气管切开插入气管切开管,经颈动脉置管测定大鼠平均动脉压、心率并抽取动脉血行血气分析,然后从颈静脉注入三油精建立脂肪栓塞大鼠动物模型。术后处死取其双肺进行大体标本观察,行HE常规染色,光镜观察。结果:本法制作的急性脂肪栓塞大鼠动物模型小剂量组成功率为90%,大剂量组成功率为70%,符合急性脂肪栓塞大鼠病理及病理生理学改变。结论:用该方法建立急性脂肪栓塞有很高的科研价值和可行性。
【关键词】三油精; 脂肪栓塞; 大鼠; 动物模型
【中图分类号】R683 【文献标识码】A 【文章编号】1008-6455(2010)08-0003-02
The establishment of the experimental animal model of acute fat embolism induced by triolein
Liu Zhengyuan1 Zhang Jinsong2
【Abstract】Objective:To establish the model of fat embolism,which was well-controlled, easily repetitive,and accessible. Methods:First, the rat is anesthetized and a tracheotomy performed in order to insert a catheter into thetrachea to facilitate breathing,then measuring the mean artery pressure and the heart rate of the rat through the jugular arterial catheter,and arierial blood is taken out for blood gas analysis,while injecting triolein into its jugular vein to establish fat embolism model.After the rat has survived enough time,it is killed, and its lung tissues are took out of the body stained with H.E for observation. Results:The successfulrate ofthe establishment of fat embolism model was up to 70% in huge dosage group,and 90%.in small dosage group. The rats in test group accorded with the characteristics ofFE in pathology and pathophsiology. Conclusions:Our way ofthe establishment of the model of fat embolism not only owns greatscientific research value,but also has very high feasibility.
【Key words】Triolein;Fat embolism;Rat;Animal model
脂肪栓塞(Fat Embolism, FE) 是各种原因导致脂肪进入血液循环,在血管内出现大量脂肪滴引起广泛栓塞,从而引起一系列病理生理改变与临床表现。FE在创伤病人中十分常见,尤其常见于长骨或骨盆骨折。Allardyce研究了43例股骨活动性骨折的病人发现95%的病人血循环中有脂肪球。Fabian前瞻性地研究了为期12个月的股骨、胫骨、骨盆骨折的病人,在这些人中,脂肪栓塞综合征(FES)的发病率至少为11%。Fabian报道该病病死率为10%,而Bulger报告为7%[1]。在该病的科研中,FE动物模型具有至关重要的作用。我们建立的三油精诱导的大鼠FE动物模型,具有可控性强、重复性好、简便易行的优点,从而为该病的研究提供了坚实的物质基础和实验平台,现报道如下:
1 材料
1.1 实验动物:清洁健康Wistar大鼠26只,雌雄兼顾,体重280～320g,由南京医科大学动物实验中心提供,正常饲养。
1.2 脂肪栓子:采用合肥博美生物科技有限公司提供的生化级三油精(又称油精和甘油三油酸酯,英文Triolein)作为脂肪栓子。
1.3 实验器材:美国Power Lab多功能生理监测仪、美国i-STAT血气分析仪及3+试纸片、小动物解剖器械、一次性注射器等。
2 实验动物分组
实验鼠随机分为大剂量三油精组(n=10)、小剂量三油精组(n=10)和对照组(n=6)三组。
3 实验步骤
3.1 麻醉:经腹腔推注20 %乌拉坦,剂量为1g/kg,每半小时检查一次麻醉深度,必要时可追加麻醉,剂量为100～200 mg/ kg。
3.2 模型制备:本试验采用经大鼠颈外静脉注入三油精的方法制备急性FE动物模型[2]、[3]。腹腔注射20%乌拉坦麻醉大鼠,麻醉满意后,仰卧位固定于自制大鼠手术台上,将颈部毛发剪除, 碘伏、酒精局部消毒,依次切开皮肤、皮下组织寻找颈外静脉穿刺置管,将三油精试剂用水浴复温至37℃后以0.2ml/min[3]速度缓慢注射,使其发生脂肪栓塞。术中密切观察大鼠一般生命体征,整个栓塞过程大鼠应始终保持仰卧位并保持良好的麻醉化。大剂量组注入0.6ml/kg的三油精,小剂量组注入0.2ml/kg的三油精[2]。对照组除用同容积生理盐水代替三油精外,余实验过程与试验组完全相同。
3.3 血流动力学监测:右颈动脉置管连接压力换能器后,采用美国Power Lab多功能生理监测仪于栓塞前5min测定大鼠平均动脉压(MAP)及心率(HR)并记录,栓塞后5min、30min、1 h、2 h复测上述指标。
3.4 动脉血气分析:所有大鼠麻醉后即行气管切开并插入小动物气管切开管接Y管通气,在间断吸痰、吸入氧浓度(FiO2)为21%的情况下,于栓塞前、栓塞后30分钟,分别采右颈动脉血以美国i-STAT血气分析仪行血气分析,测定PH、PaO2、PaCO2、HCO3-。
3.5 病理检查:栓塞后6h每组放血处死2只大鼠,取出肺组织,观察大体标本有无肺梗死灶,全肺以体积分数为10%的甲醛液固定,石蜡包埋切片,苏木素一伊红(HE)染色,光镜下镜检观察肺组织病理学改变。
3.6 实验结果数据处理及统计学分析:实验数据均以均数±标准差(x±s)表示,数据结果采用SPSS13.0统计学软件包进行统计分析;统计方法采用方差分析,F检验,两两间比较采用q检验,检验以P<0.05表示结果统计学差异有显著性。
4 结果
4.1 模型建立情况:小剂量三油精栓塞组建模成功率为90%(9/10),死亡率为10%(1/10) ,大剂量三油精栓塞组建模成功率为70%(7/10),死亡率为30%(3/10)。栓塞后大鼠呼吸频率立即增快,平均频率>110次/min,伴有呼吸窘迫,气管切开管中分泌物增多,严重者有大量泡沫痰涌出。动脉血气分析显示程度不等的低氧血症。
4.2 病理观察:大体标本正常肺组织表面呈淡红色,无充血、水肿及瘀血斑点(见图1);FE后肺组织充血、水肿,表面有弥漫性出血点(见图2箭头所指)。光镜下正常肺组织结构完整,肺泡内无出血及渗出(见图3);FE后大鼠肺泡水肿、肺泡壁破坏(见图4箭头所指)。
4.3 平均动脉压变化结果(表1):小剂量三油精FE组5min、0.5h、1h点MAP与对照组、注栓前比较差异有显著性,P<0.05;大剂量三油精FE组5min、0.5h、1h、2h点MAP与对照组、小剂量组比较差异均有显著性,P<0.05。
4.4 心率变化结果(表2):小剂量三油精FE组5min、0.5h、1h点HR与对照组、注栓前比较差异有显著性,P<0.05;大剂量三油精FE组5min、0.5h、1h、2h点HR与对照组、注栓前、小剂量组比较差异均有显著性,P<0.05。
4.5 血气分析变化结果(表3):小剂量FE组栓塞后60min PaO2明显降低,与对照组、注栓前比较差异有显著性,P<0.05;大剂量FE组栓塞后60min pHa、PaO2、HCO3-均明显降低,与对照组、注栓前比较差异有显著性,P<0.05;大剂量FE组栓塞后60min PaO2与小剂量组比较差异有显著性,P<0.05。
5 讨论
FE是指脂肪颗粒阻塞血管腔而引起的一系列病理生理改变的临床疾病。临床所见的FE可以见于整形外科吸脂术、骨科长骨骨折、骨关节矫形手术、脂肪肝挤压伤等。
关于FE的动物模型:实验动物的种类包括大鼠、猫[3]、家兔[6]、绵羊[7]、犬[8]、猪[9]及灵长类动物, 其中灵长类动物由于与人类在遗传进化水平上最接近, 故是最理想的实验动物, 但这种动物价格昂贵, 未能广泛用于实验中。与其它几种实验动物相比, 大鼠繁殖快, 较易得到, 价格上又较低廉, 适用于大样本的动物实验, 值得在动物试验中推广。脂肪栓子的种类包括:自体脂肪细胞、油酸、三油精[2]。以自体脂肪细胞作为栓子制作FE动物模型,虽然可以较为真实地模拟FE发生的过程,但是提取与纯化自体脂肪细胞需要较复杂的技术和设备,实施起来有较高难度。以油酸作为栓子制作FE动物模型,由于游离脂肪酸对肺毛细血管内皮细胞的毒性作用,易导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)发生,所以油酸常用以制作ARDS的动物模型。三油精是一种不饱和的甘油酯,存在于动物和植物脂肪和油中,由动植物油类分离而制得,黄色油状液体,密度0.915,熔点-4～-5℃,不溶于水,微溶于乙醇,溶于氯仿、乙醚、四氯化碳[10]。三油精可以作为天然脂肪栓子用于FE的动物模型的制备,国外已有多位学者进行了相关研究[2-4],但在国内尚无此类报道。以三油精作为脂肪栓子制作FE动物模型有如下优点:(1)成分单一,剂量容易把握,可重复性强,实验结果可靠;(2)取材简单,有专门厂家提供,且价格低廉。
当肺动脉主干或广泛肺动脉脂肪栓塞时,其急性期病理生理变化主要表现为血流动力学改变和呼吸生理改变。肺动脉栓塞的机械阻塞造成肺有效血管床横断床面积减少,由此引发的神经体液因素造成肺动脉持续痉挛,导致肺动脉高压形成。当肺动脉压持续升高超过右心负荷时,就造成急性右心衰竭。此时内脏血管强烈收缩,外周循环阻力增加,左心室回心血量严重不足,体循环血压降低,严重时表现为休克症状[11]。
本实验中FE大鼠早期均迅速出现不同程度的低血压和心率减慢,大剂量组血压、心率迅速下降,与小剂量组比较在统计学上有显著差异。大剂量脂肪栓塞(0.6ml/kg三油精)对血压和心率的影响较小剂量脂肪栓塞(0.2ml/kg三油精)明显。提示FE的后果,与进入血循环的脂滴数量的多少有关。急性FE时发生心率减慢、血压下降的机制:在心房、心室和肺循环大血管壁内存地许多感受器,总称为心肺感受器,其传入神经纤维行走于迷走神经干内。当心房、心室或肺循环大血管中压力升高或血容量增多而使心脏或血管壁受到牵张时,这些机械或压力感受器就发生兴奋。大多数心肺感受器受刺激时引起的反射效应是心交感和交感缩血管紧张降低,心迷走紧张加强,导致心率减慢,心输出量减少,外周血管阻力降低,故血压下降[12]。急性FE早期出现低血压与心率减慢有其生理学基础,符合生理学规律。
本实验中FE后大鼠呼吸急促、PaO2明显下降,符合FE的病理生理改变[13],也符合Gurd和Wilson于1974年提出的的临床诊断标准[14];大体标本观察见肺组织充血、水肿,表面有弥漫性出血点,经HE染色光镜下观察见肺泡水肿、肺泡壁破坏均符合FE时早期的病理学变化。局限性在于未能充分评价FE的量与PaO2改变的关系,PaO2水平能否反映栓塞面积有待于进一步观察。
总之,本研究特色和创新之处在于:(1)以三油精为脂肪栓子、以大鼠为实验动物构建了FE动物模型;(2)从血流动力学角度研究了急性FE早期的发病机制; (3)探讨了不同剂量脂肪栓子对大鼠肺组织的病理性损害;(4)采用的FE动物模型具有简便易行、可控性强、可重复性高的特色。用本方法建立的动物模型符合急性FE的病理学及病理生理学改变,具有较高的科研价值和可行性,可作为系统研究该病的基础。
附图:
参考文献
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