摘要[目的] 从海洋中分离并筛选具有杀松材线虫活性的细菌。[方法] 采用稀释涂布平板法对采自青岛近海海域的样品进行细菌分离，采用浸渍法测定菌株的杀线虫活性，并对筛选菌株的形态学、生理生化特性和16S rDNA序列进行测定，通过单因素试验筛选产生杀线虫活性物质的最适培养条件。[结果] 共分离到36株海洋细菌，根据杀线虫活性筛选出1株具有高杀线虫活性的细菌HT11。该菌株分离自牡蛎，其培养滤液处理松材线虫24 h的校正死亡率高达92.41%。根据形态学、生理生化特性和16S rDNA序列测定及其系统发育分析结果，将菌株HT11鉴定为考克氏菌属（Kocuria）。单因素试验结果表明，该菌株在营养肉汤（NB）培养基中产生杀线虫活性物质的最适培养条件为：海水浓度100%，初始pH 7.0，培养温度25 ℃，培养时间3 d。[结论] 该研究可为海洋微生物资源的开发及其杀松材线虫天然活性物质的利用提供理论依据。
关键词海洋细菌；杀线虫活性；松材线虫；鉴定；培养条件
中图分类号S767.3+2文献标识码A文章编号0517-6611（2016）04-024-05
Identification and Culture Conditions of Marine Bacterium HT11 with Nematicidal Activity against Bursaphelenchus xylophilus
CHEN Congcong，GUO Qunqun，WANG Chao，GUO Daosen* et al （College of Life Sciences，Qingdao University，Qingdao，Shandong 266071）
Abstract [Objective] To isolate and screen the marine bacteria with nematicidal activity against Bursaphelenchus xylophilus from the sea.[Method] The marine bacterial strains were isolated from the samples collected from the subtidal zones near Qingdao coast using the dilution and streak plate method； nematicidal activity of strains were detected by immersion method.The morphology，physiological and biochemical characters，and 16S rDNA sequence of the screened strains were also detected.The optimal cultivation conditions to produce nematicidal activity substances were detected by single factor test.[Result] A total of 36 marine bacterial strains were isolated from the samples.One of these strains HT11 had high nematicidal activity，which was isolated from oyster.Its corrected mortality reached as high as 92.41% after treated with the culture filtrate for 24 h .According to the results of morphology，physiological and biochemical characters，16S rDNA sequence and phylogenetic analysis，strain HT11 was classified into the genus of Kocuria.Results of single factor experiment indicated that the optimal cultivation conditions of HT11 for the production of nematicidal substances were 100% seawater concentration，initial pH 7， 25 ℃ cultivation temperature，and 3 d cultivation time.[Conclusion] This research provides theoretical foundation for the development of marine microorganism resources and the utilization of natural nematicidal substances.
Key wordsMarine bacteria； Nematicidal activity； Bursaphelenchus xylophilus； Identification； Culture conditions
松树萎蔫病（Pine wilt disease，PWD）是松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）入侵松属植物后引起寄主萎蔫并快速枯死的一种毁灭性疾病[1]，传播媒介为松墨天牛（Monochamus alternatus）。该病在全球范围内造成了巨大的经济损失和生态环境的破坏，在东亚尤其是日本、中国、韩国[2]以及西欧的葡萄牙[3]和西班牙[4]损失较为严重。我国于1982年首次在江苏省南京市发现该病，截至2011年已扩散至全国14个省（市），且呈扩大趋势，随着国际贸易的往来，该病传播扩散的速度也在不断加快，因此松树萎蔫病已經引起许多国家的高度重视[5]。在控制该疾病方面，一般采用物理方法和化学方法，例如对患有松树萎蔫病的松树进行砍伐和用烟熏蒸来控制昆虫媒介[6]，向染病区域喷施噻虫啉等杀虫药剂[7]，对树干注射合成农药（阿维菌素或甲维盐）[7]或者在疫区周围减少松林的种植等，而这些方法中最有效的是化学农药防治方法。然而，化学农药具有高毒、高残留的特点，可对空气、水体和土壤环境造成污染，间接对人类造成危害[8]，因此化学药剂的应用正在逐步受到限制。目前，从自然界中寻找对松材线虫具有高致死性的微生物及其代谢产物已成为研发新型杀线虫剂的研究热点之一。这些微生物大多数是来自陆生环境的捕食性真菌、内寄生真菌、产毒真菌、杀线虫细菌和杀线虫放线菌等[9-10]。由于海洋存有高压、高盐、寡营养、低温等特殊生境，促使海洋微生物在进化过程中具备与陆地微生物不同的特殊代谢途径，从而可能会出现种类繁多、结构新颖、生物活性强的代谢产物。近年来，具有杀线虫活性的海洋微生物已有报道。郑海营等[10]从沙蟹体内分离出2株具有高杀松材线虫活性的巨大芽孢杆菌（Bacillius megaterium）。于洁等[11]从菲律宾蛤仔消化道内分离出1株产黑假交替单胞菌（Pseudoalteromonas nigrifaciens），其培养滤液处理松材线虫24 h校正死亡率为82%。Yu等[12]研究了1株分离自海水的海假交替单胞菌（Pseudoalteromonas marina）和1株分离自海湾扇贝的Vibrio atlanticus的杀线虫活性，发现这2株细菌培养液中的挥发性有机化合物对松材线虫有很强的杀灭作用。徐中强等[13]从青岛附近海域中分离到1株具有强杀线虫活性的轮枝孢属（Verticillium）真菌，该菌菌丝的破碎滤液处理松材线虫28 h校正杀死率为84.1%。李子等[14]从青岛附近海域分离的35株真菌中筛选到1株青霉属（Penicillium）菌株ML5，用其发酵液处理松材线虫72 h的校正死亡率为86.51%。笔者对分离自青岛近海海域样品中的海洋细菌进行了杀松材线虫活性菌株的筛选和鉴定，并对高杀线虫活性菌株产杀线活性物质的最佳培养条件也进行了探索，旨在为海洋微生物资源的开发和杀松材线虫天然活性产物的利用提供理论依据。
1材料与方法
1.1样品的来源与供试线虫的培养海泥、海沙、海洋动物等样品在海水落潮时从第一海水浴场、麦岛、薛家岛、石老人、流清河湾等青岛近海海域采集。供试线虫为无菌松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus），由青岛大学生命科学学院微生物实验室提供，无菌线虫的培养参照文献[15]的方法。
1.2海洋细菌的分离培养基选用全海水营养琼脂（NA）（蛋白胨10.0 g、牛肉粉3.0 g、氯化钠5.0 g、琼脂粉15.0 g、陈海水1 000 mL，pH（7.3±0.1），121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min）培养基。海泥、海沙样品细菌的分离采用稀释平板涂布法[16]。首先取10 g样品置于90 mL无菌海水在振荡器中振荡25 min，静置后对悬液进行10倍梯度稀释；然后，取各梯度稀释液100 μL涂布于培养基上。海洋动物样品先用无菌海水冲洗体表，然后用酒精棉球擦拭消毒，用解剖工具取出消化道内容物约1 g，置于9 mL无菌海水中充分混匀，进行稀释平板涂布法分离。将涂布的平板于28 ℃下培养3～5 d。根据样品和菌落形态的不同，挑取具有代表性的菌落进行纯化，将纯化好的菌株接种到试管斜面培养基上保存备用。
1.3杀线虫活性菌株的筛选将纯化好的待测菌株进行活化，接种于装有25 mL全海水营养肉汤（NB）液体培养基的100 mL三角烧瓶中，于25 ℃、185 r/min振荡培养3 d；然后，取1 mL培养液于EP管中，12 000 r/min离心10 min；最后，取上清液，用0.45 μm孔径的微孔滤膜对其进行过滤，即得到菌株的培养滤液。采用浸渍法[17]对菌株的培养滤液进行杀线虫活性的测定。取约2 mL无菌水将三角烧瓶瓶壁上的线虫冲洗下来，用无菌水配制成2 000条/mL的线虫悬液。分别取培养滤液450 μL和线虫悬液50 μL，加至已杀菌的24孔细胞培养板中混匀，以无菌水和不接菌的培养基滤液分别作为对照，每个处理重复3次，置于25 ℃恒温培养箱中，每6 h在体视显微镜下观察线虫的存活情况，线虫的死亡标准为虫体僵直，当重新转移到无菌水中时用解剖针刺激无反应[18]。处理24 h后，按照以下公式计算线虫校正死亡率：CM（%）=（d-c）/（1-c）×100。式中，CM为校正死亡率（%）；c为对照组死亡率（%）；d为处理组死亡率（%）。
1.4菌株HT11的鉴定
1.4.1形态特征及生理生化特性测定。将菌株接种于全海水营养琼脂（NA）培养基平板上，25 ℃下恒温培养2 d，观察菌落的形态、大小、边缘、颜色等培养特征，对菌体进行革兰氏染色和显微形态观察，并对菌体的大小进行测量。参照《常见细菌系统鉴定手册》[19]的方法对菌株进行生理生化特性的测定。
1.4.216S rDNA序列分析。从菌体中提取基因组DNA，以提取的DNA为模板，采用通用引物（上游引物：5′GCGCAAGCTTAGAGTTTGATCMTGGCTCAG3′；下游引物：5′GCGCTCTAGATACGGTYACCTTGTTACGACTT3′）进行PCR扩增反应，PCR反应程序为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃修复延伸10 min。纯化后的16S rDNA片段克隆于pClone EZ cloning vector载体，由上海生工公司完成测序。经测序后，利用NCBI网站上的GenBank数据库进行BLAST分析，筛选出同源性较高的16S rDNA的基因序列作为参比对象，对克隆片段进行序列分析，使用Clustal X 1.83软件和MEGA 5.1软件对序列进行多序列比对和编辑后，采用Neighbor-joining（N-J）法构建系统发育树[20]。
1.5不同培养条件对菌株HT11杀线虫活性的影响将菌株活化24 h，接种于装有30 mL营养肉汤（NB）液体培养基的100 mL三角烧瓶中。采用单因素试验研究培养基中海水浓度（0、200、400、600、800、1 000 mL/L）、初始pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）、培养温度（15、20、25、30、35、40 ℃）和培养时间（1、3、5、7、9、11 d）对菌株HT11的培养滤液杀线虫活性的影响，每个处理重复3次。
2结果与分析
2.1杀线虫海洋细菌的分离和筛选对采集的样品中进行细菌分离后，共得到36株海洋细菌，经过杀线虫活性测定发现，其中线虫的校正死亡率大于50%的菌株有7株（表1），占总数的19.44%。其中，从麦岛附近海域采集到的牡蛎消化道中分离到的菌株HT11的培养滤液杀线虫活性最强，处理松材线虫24 h后线虫的校正死亡率达到92.41%，松材线虫的死亡状态如图1所示。因此，选择菌株HT11进行后续试验。
2.2菌株HT11的鉴定
2.2.1形态特征及生理生化特性。从图2可以看出，菌株HT11的菌落为圆形，表面黏稠，光滑，隆起，浅黄色，不透明，边缘整齐。从图3可以看出，细胞呈球形，直径为0.5～1.0 μm，不运动，革兰氏染色为阳性。对菌株HT11进行了15项生理生化测定，结果表明该菌株具有耐盐性，能够在NaCl质量分数为2%～14%的培养基上生长，接触酶、氧化酶反应呈阳性，能还原硝酸盐和利用柠檬酸盐，不能水解明胶，V.P.试验、吲哚试验、精氨酸利用试验结果均呈阴性，在糖发酵试验中能够利用葡萄糖、果糖、蔗糖和半乳糖，不能利用麦芽糖和木糖（表2）。
2.2.216S rDNA的序列及系统发育分析。对菌株HT11的16S rDNA片段进行PCR，扩增到1条1 441 bp大小的电泳目的条带，将测序结果在NCBI网站中进行BLAST比对，其同源性较高的菌株均属于考克氏菌属（Kocuria）。选取同源性高的菌株的序列，使用Clustal X 1.83软件和MEGA 5.1软件，采用Neighbor-joining（N-J）法构建系统发育树。从图4可以看出，菌株HT11与Kocuria carniphila （NR_027193）在進化中有较高的同源性，结合其形态学特征和生理生化特点，将菌株HT11归为考克氏菌属（Kocuria）。
2.3培养条件对菌株HT11杀线虫活性的影响从图5可以看出，培养滤液的杀线虫活性随着培养基中海水浓度的不断增加而增高，当培养基中海水浓度为100%时校正死亡率90.93%，杀线虫活性最强。
从图6可以看出，当培养基初始pH为6.5～8.0时，线虫的校正死亡率均较高（70.00%以上）；当pH为7.0时，线虫死亡率最高（90.50%），表明该起始pH最适合产生杀线活性物质。
从图7可以看出，当培养温度为40 ℃时，线虫校正死亡率为0，表明菌株HT11在此温度下并未生长；在15～35 ℃范围内，随着温度的升高，杀线虫活性呈先升高后降低的趋势，当培养温度为25 ℃时校正死亡率最高，为89.59%。因此，培养温度25 ℃为最适宜产生杀线活性物质的温度。
从图8可以看出，随着培养时间的增加，培养滤液杀线虫活性呈先升高后降低的趋势，3 d杀线虫的校正死亡率最高，达到91.37%。
3讨论
自1982年在南京发现松树萎蔫病以来，我国已经有超过40万hm2的松林感染该病和造成5亿多株松树的死亡，经济损失严重[11]。目前，针对松树萎蔫病主要采用化学防治的方法来治理，但是大量使用化学药剂后会产生严重的负面作用。因此，研究人员逐渐将目光投向于从自然界中寻找杀线虫活性的天然产物。受制于各种条件，人们目前只能在有限的范围内寻找杀线虫活性的天然产物，更多地倾向于在陆地上寻找生防植物或生防微生物。Zheng等[21]从206株植物内生细菌中筛选出1株具有较强杀线虫活性的菌株LCB-3，经鉴定该菌株为缺陷短波单胞菌（Brevundimonas diminuta），并从该菌株的发酵滤液中分离到杀线虫活性物质（R）-（-）-2-ethylhexan-1-ol。Sung等[22]从韩国土壤中发现了松材线虫内寄生真菌（Esteya vermicola）的1个新菌株，通过对松树进行接种发现该菌株生长在松树的幼树中，随后侵染存在于松树中的松材线虫，使其能够在4～5 d内死亡。与陆地环境相比，海洋环境更为复杂，蕴含着更为丰富的微生物资源。近年来，随着科学技术的进步，人们也更多着眼于在海洋环境下去寻找杀线虫活性的天然产物，目前从海洋中分离出产杀线虫活性物质的微生物有巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）[10]、弧菌（Vibrio atlanticus）[11]、产黑假交替单胞菌（Pseudoalteromonas nigrifaciens）[11]、青霉菌（Penicillium sp.）[12]、轮枝孢属菌（Verticillium sp.）[13]等，并且部分海洋微生物产生的杀线虫剂活性物质与陆地上微生物产生的杀线虫剂活性物质相比在结构上更稳定，在效用上更高效。笔者从采自青岛沿海海域的样品牡蛎中分离到1株具有较高杀线虫活性的海洋细菌HT11，其培养滤液处理松材线虫24 h后校正死亡率达92.41%，经过对其形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析，将该菌株归为考克氏菌属（Kocuria）。通过对培养条件的研究发现，当培养基中海水浓度100%、初始pH 7.0、培养温度25 ℃、培养时间3 d时，菌株HT11的杀线虫活性最强。
考克氏菌（Kocuria spp.）是一类革兰氏阳性菌，适应环境能力很强，可以从海洋沉积物、土壤、沼泽、发酵食品等多种环境中分离到。1995年该菌属（Kocuria）以斯洛伐克微生物学家Miroslav Kocur的姓氏来命名。迄今为止，从考克氏菌属中已经鉴定了12个种，模式菌株为Kocuria rosea[23]。张文俊等[24] 从东海深处分离到1株产类胡萝卜素的海洋细菌，经过鉴定，命名为Kocuria sp.CAR-red。徐姮等[25]从深海多种微生物中筛选到1株产木聚糖酶的考克氏菌Kocuria sp.Mn22。Jiang等[26]从印度洋沉积物中分离出1株考克氏菌，经鉴定为一个新种Kocuria subflava sp.nov.。由此可见，海洋中存在考克氏菌种类，并且有望发现更多新种和新的活性天然产物。笔者从采自青岛近海海域的牡蛎体中分离到1株考克氏菌，经测定该菌株具有很强的杀松材线虫活性，这是有关考克氏菌具有杀松材线虫活性的首次报道。该试验结果可为发现新的杀线虫天然产物提供研究材料，并为海洋微生物活性物质在杀线虫剂的开发和利用方面提供重要参考。此外，对菌株HT11杀线活性化合物的提取纯化、结构鉴定及其杀线虫机制有待于进一步研究。
参考文献
[1] 秦复牛，潘沧桑.松材线虫病的研究进展[J].安徽农业大学学报，2003，30（4）：370-376.
[2] ZHAO B G，FUTAI K，SUTHER J，et al .Pine wilt disease[M].Tokyo：Springer，2008：33-34.
[3] MOTA M M，BRAASCH H，BRAVO M A，et al.First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe[J].Nematology，1999，1：727-734.
[4] ABELLEIRA A，PICOAGA A，MANSILLA，J P et al.Detection of Bursaphelenchus xylophilus，causal agent of pine wilt disease on Pinus pinaster in northwestern Spain[J].Plant disease，2011，95：776.
[5] 潘滄桑.松材线虫病研究进展[J].厦门大学学报（自然科学版），2011，50（2）：446-483.
[6] LEE S M，CHUNG Y J，MOON Y S，et al.Insecticidal activity and fumigation conditions of several insecticides against Japanese pine sawyer （Monochamus alternates）larvae[J].Journal of the Korean forestry society，2003，92：191-198.
[7] KOREA FOREST SERVICE.Guideline for the control of forest diseases and insect pests[M].Daejeon，Republic of Korea：Korea Forest Service，2013：325.
[8] KWON T S，SHIN J H，LIM J H，et al.Management of pine wilt disease in Korea through preventative silvicultural control[J].Forest ecology and management，2011，261（3）：562-569.
[9] 朱麗梅，吴小芹，徐旭麟.松材线虫拮抗细菌的筛选和鉴定[J].南京林业大学学报（自然科学版），2008，32（3）：91-94.
[10] 郑海营，于洁，李荣贵，等.两株具有杀松材线虫活性海洋细菌的筛选和鉴定[J].青岛大学学报（工程技术版），2012，27（1）：1-8.
[11] 于洁，李子，周长景，等.杀线虫海洋细菌G-23的鉴定及培养条件研究[J].青岛大学学报（工程技术版），2014，29（2）：94-100.
[12] YU J，DU G，LI R，et al.Nematicidal activities of bacterial volatiles and components from two marine bacteria，Pseudoalteromonas marina strain H42 and Vibrio atlanticus strain S16，against the pine wood nematode，Bursaphelenchus xylophilus[J].Nematology，2015，17（9）：1011-1025.
[13] 徐中强，于洁，刘超，等.一株具有杀松材线虫活性海洋真菌的筛选和初步鉴定[J].青岛大学学报（工程技术版），2013，28（2）：70-76.
[14] 李子，周长景，陈聪聪，等.杀松材线虫海洋真菌ML-5的鉴定及培养条件研究[J].青岛大学学报（工程技术版），2015，30（2）：102-107.
[15] 李盛楠，赵博光，李荣贵，等.表达荧光假单胞菌鞭毛蛋白工程菌的构建及其对黑松的毒性[J].青岛大学学报（工程技术版），2010，25（2）：35-40.
[16] 沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验[M].3版.北京：高等教育出版社，1999：70-72.
[17] 孙世伟，刘爱勤，苟亚峰，等.20种植物提取物对南方根结线虫的毒杀活性[J].热带农业科学，2009，29（10）：30-33.
[18] DONG J Y，LI X P，LI L，et al.Preliminary results on nematicidal activity from culture filtrates of Basidiomycetes against the pine wood nematode，Bursaphelenchus xylophilus （Aphelenchoididae）[J].Annals of microbiology，2006，56（2）：163-166.
[19] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.
[20] KUMARS S，TAMURA K，NEI M.MEGA3：Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment[J].Briefings in bioinformatics，2004，5（2）：150-163.
[21] ZHENG L J，LI G H，WANG X B，et al.Nematicidal endophytic bacteria obtained from plants[J].Annals of microbiology，2008，58（4）：569-572.
[22] SUNG C K，FANG Z M，WANG C Y，等.利用松材线虫的内寄生真菌Esteya vermicola防治松萎蔫[J].南京林业大学学报，2001（1）：143-144.
[23] 唐然，袁梦龙，吴菁，等.一株耐辐射考克氏菌的分离与鉴定[J].核农学报，2010，24（2）：276-279.
[24] 张文俊，田宏，杨桥，等.一株产类胡萝卜素海洋细菌的分离及系统分类学研究[J].中华航海医学与高气压医学杂志，2009，16（5）：269-273.
[25] 徐妲，李婵娟，洪玉枝.考克氏菌木聚糖酶发酵条件的优化[J].华中农业大学学报，2009，28（6）：701-704.
[26] JIANG Z，ZHANG W H，YUAN C G，et al.Kocuria subflava sp.nov.，isolated from marine sediment from the Indian Ocean[J].Antonie van Leeuwenhoek，2015，108（6）：1349-1355.