[摘要] 该文采用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS），建立大鼠血浆中槲皮素（QCT）、山柰酚（KMF）、异鼠李素（ISR）、银杏内酯A（GA）、银杏内酯B（GB）、银杏内酯C（GC）、白果内酯（BB）7种成分的分析方法。同时，探讨单次灌胃给药银丹心脑通软胶囊后上述7种成分在大鼠体内的药代动力学特征。方法学考察结果表明，7种化合物线性关系良好（r≥0.997 1），日内、日间精密度和准确度的RSD均小于11%，基质效应和回收率分别为93.28%～103.6%和72.43%～95.77%，样品室温放置6，12 h，-20 ℃反复冻存和-20 ℃长期冻存后基本稳定，其RSD均在11%以下，方法学考察符合生物样品分析要求。大鼠灌胃银丹心脑通软胶囊后，上述7种成分的血浆药代动力学参数如下： Cmax （45.02±11.28），（49.90±13.82），（27.85±8.38），（76.31±18.19），（76.54±15.43），（35.35±10.28），（48.70±12.34） μg·L-1；tmax （0.33±0.11），（0.50±0.23），（0.33±0.14），（0.75±0.29），（1.0±0.35），（1.5±0.23），（0.75±0.50） h；該研究建立的UPLC-MS/MS方法适于对大鼠口服银丹心脑通软胶囊后的槲皮素、山柰酚、异鼠李素、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和白果内酯的药代动力学研究。
[关键词] 银丹心脑通软胶囊； 活性成分； 血浆； 药代动力学
[Abstract] To estabish ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method for simultaneous determination of quercetin（QCT）， isorhamnetin（ISR）， kaempferol（KMF）， ginkgolide A（GA）， ginkgolide B（GB）， ginkgolide C（GC） and bilobalide（BB） in rat plasma and investigate the pharmacokinetic process of seven compounds after oral administration of Yindan Xinnaotong Ruanjiaonang， The results indicated that all calibrations curves showed good linearity （r≥0.997 1）. RSD of intra-day and inter-day precisions were all within 11%. The matrix effects and extraction recovery were in the range of 93.28%-103.6% and 72.43%-95.77% respectively. The peak concentration （Cmax） of QCT， ISR， KMF， GA， GB， GC and BB were （45.02±11.28）， （49.90±13.82）， （27.85±8.38）， （76.31±18.19）， （76.54±15.43）， （35.35±10.28）， （48.70±12.34） μg·L-1， respectively. The peak time （tmax） of seven constituents were （0.33±0.11）， （0.50±0.23）， （0.33±0.14）， （0.75±0.29）， （1.0±0.35）， （1.5±0.23）， （0.75±0.50） h， respectively. UPLC-MS/MS method established in this research was proved to be so rapid and sensitive that it can be applied to the pharmacokinetic study of seven bioactive constituents in Yindan Xinnaotong Ruanjiaonang.
[Key words] Yindan Xinnaotong Ruanjiaonang； bioactive compounds； rat plasma； pharmacokinetics
银丹心脑通软胶囊（YXC）是贵州百灵企业集团制药股份有限公司在20世纪70年代根据苗族医学“两病两纲”理论研制的复方制剂，由银杏叶、丹参、绞股蓝、灯盏细辛、大蒜、三七、山楂、天然冰片8味中药组成，具有活血化瘀、行气止痛、消食化滞等功效[1]，主要用于气滞血瘀引起的胸痹，症见胸闷、气短、心悸等。目前，银丹心脑通软胶囊已被《中国药典》2015年版收载，是目前临床上广为应用的大品种民族药物。为了阐明银丹心脑通软胶囊科学内涵，课题组前期对银丹心脑通软胶囊化学成分、药理作用及作用机制进行了较为系统和深入的研究。采用UPLC-MS/MS在银丹心脑通软胶囊中鉴别出70个化合物，其中黄酮类和银杏内酯为其主要成分，且大部分黄酮类成分是以槲皮素、山柰酚和异鼠李素为苷元的苷类化合物[2]。药效学研究表明，银丹心脑通软胶囊结合游泳运动后能够改善动脉粥样硬化大鼠的血液流变学指标，对动脉粥样硬化有积极的预防作用，其作用机制可能与减少内皮细胞ICAM-1，PECAM-1的分泌，抑制细胞凋亡有关[4-6]。此外，银丹心脑通软胶囊、主要成分及主要成分配伍对离体心脏缺血再灌注损伤有一定的保护作用，其作用机制可能与抗氧化、减轻钙超载、减少炎性因子释放、调节Toll 样受体相关[7-8]。
中药复方化学组成复杂，其所含的化学成分在生物活性、理化性质和含量等方面存在明显差异，因此药效作用可能主要来自其所含的的部分关键成分[9]。前期研究发现银丹心脑通软胶囊中黄酮类成分槲皮素、山柰酚、异鼠李素、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯含量较高，且这些成分具有抗炎、抗氧化、扩张血管、抑制血小板聚集、抗动脉粥样硬化及对心肌缺血再灌注后的损伤具有保护作用[10-11]，这些成分的药理作用及作用机制与课题组前期对银丹心脑通软胶囊研究相吻合，因此，认为这些成分可能为银丹心脑通软胶囊中的关键成分。研究表明，药效活性较强且体内暴露显著的成分可能为复方中的药效物质基础，为了阐明银丹心脑通软胶囊药效物质基础，本实验建立高效、便捷、灵敏的UPLC-MS/MS方法，用于测定大鼠口服银丹心脑通软胶囊后7种主要活性成分的血药浓度，并用于银丹心脑通软胶囊在大鼠体内的药代动力学研究，为最终阐明银丹心脑通软胶囊药效物质基础、药物安全性评价、临床应用提供科学依据。
1 材料
1.1 仪器
Agilent 6490 QQQ LC-MS分析系统，包括Agilent UPLC 1290液相色譜仪及Agilent 6490 QQQ三重四极杆质谱检测器（美国Agilent公司），Mass-hunter工作站（美国Agilent公司）；QL-901涡旋混合器（江苏海门市麒麟医用仪器有限公司） ；Backman J30i离心机（美国Backman公司）；1/10万分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；NA-5L氮气-空气一体机（北京中兴汇利科技有限公司）。
1.2 试剂与药品
异鼠李素（批号110860-201109）、银杏内酯A（批号110862-201310）、银杏内酯B（批号110863-201209）、银杏内酯C（批号110864-201307）、白果内酯（批号110865-201306）购于中国食品药品检定研究院；槲皮素（批号H-009-131012）、山柰酚（批号S-014-131118）购于成都瑞芬思生物科技有限公司；黄芩素（IS，批号CHB-H-041，成都克洛玛生物科技有限公司）。所有对照品纯度均大于98%。甲醇为色谱级（北京化工厂），乙腈为HPLC级（美国Fisher公司），乙酸乙酯（北京化工厂），98%甲酸（国药集团化学试剂有限公司），β-葡萄糖醛酸酶、硫酸酯酶（美国Sigma-Aldrich公司）。银丹心脑通软胶囊（贵州百灵企业集团制药股份有限公司，批号20140426）。
1.3 动物
SD大鼠，雄性，体质量（250±20） g，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号SCXK（军）2012-0004。
2 方法
2.1 给药与样品采集
取健康SD大鼠6只，实验前12 h禁食不禁水。灌胃银丹心脑通软胶囊（2.4 g·kg-1），分别于给药后5，10，15，20，30，45，60，90，120，150，180，240，360，480，720，1 440 min经大鼠眼球后静脉丛采血约0.5 mL，置肝素化试管中，4 000 r·min-1离心10 min，分取上清，血浆置于-20 ℃冰箱中保存待测。
2.2 血浆样品处理方法
取出样品，37 ℃水浴解冻后，精密吸取血浆样品200 μL，加入0.2 mol·L-1醋酸盐缓冲液（pH 4.6）（0.2 mol·L-1醋酸钠和醋酸以4.69∶5.10混合）120 μL，加入内标溶液100 μL，再加入980 U·mL-1葡萄糖醛酸苷水解酶和硫酸酯酶[以pH 4.6 0.2 mol·L-1醋酸盐缓冲液稀释葡萄糖醛酸苷水解酶和硫酸酯酶而得]80 μL，37 ℃振荡水浴下水解30 min，加入甲醇600 μL终止反应。涡旋2 min后，13 000 r·min-1离心10 min，取上清液，50 ℃下氮气吹干，加入甲醇200 μL溶解，15 000 r·min-1离心10 min，取上清液进样分析。
2.3 对照品溶液及内标溶液的配制
精密称取槲皮素（QCT），山柰酚（KMF），异鼠李素（ISR），银杏内酯A（GA），银杏内酯B（GB），银杏内酯C（GC），白果内酯（BB）和黄芩素（IS）对照品适量置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀后，按一定比例配置成混合对照品储备液。取黄芩素1 mg，加甲醇稀释至质量浓度为100 μg·L-1内标液。
2.4 系列基质标准曲线样品和质控样品制备
混合对照品储备液以75%甲醇溶液按一定比例稀释，得QCT，ISR，KMF，GA，GB，GC，BB质量浓度为1，5，10，20，50，100 μg·L-1的系列混合对照品溶液。取空白血浆加入系列混合对照品溶液得系列基质标准曲线样品。取200 μL血浆，加入混合对照品工作溶液低、中、高3个浓度的样品，按2.2项处理得到含对照品的质控样品，进UPLC-MS/MS分析。
2.5 色谱和质谱条件
色谱柱为Agilent SB-Aq C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脱0～1.0 min，75%～10% A；1.0～3.5 min，10%～10% A；3.5～5.0 min，75%～10% A。流速0.3 mL·min-1，柱温30 ℃。
APCI ESI离子源，MRM模式，碎裂电压均为350 V，离子源条件为干燥气温度290 ℃；干燥气体流速15 L·min-1；雾化气压力50 psi（1 psi=6.895 kPa）；鞘气温度350 ℃，流速12 L·min-1。在0～1 min，通过切换阀将色谱柱流出的组分切至waste阀，以免污染质量分析器。QCT，KMF，ISR，GA，GB，GC，BB和IS采用负离子扫描模式，定量分析离子对质谱条件见表1。各化合物的产物离子质谱图见图1。
2.6 方法学考察
2.6.1 专属性考察 取大鼠空白血浆、空白血浆加对照品和内标、给药后血浆样品（加内标），其余按2.2项下方法操作，获得各供试品色谱图，考察是否存在内源性干扰。
2.6.2 标准曲线与最低定量限 取系列浓度的基质标准曲线样品，按2.2项下处理，建立UPLC-MS/MS方法分析后，以样品浓度（X）为横坐标，待测成分峰面积与内标峰面积的比值（Y）为纵坐标，以加权（权重1/X2）最小二乘法进行线性回归计算，进行线性回归，得到待测样品标准曲线、线性范围、相关系数和定量下限，实验以S/N≥10作为定量标准。
2.6.3 准确度和精密度 按2.4项下方法配置低、中、高3个质量浓度的质控样品，每个浓度取6份样本，1 d内分别测定6份样品，分别取1份样品，连续测定3 d，计算待测样品峰面积和内标峰面积的比值，代入当天的标准曲线求得实测浓度及实测浓度准确度，计算日内、日间精密度和准确度，以相对标准偏差（RSD）表示。
2.6.4 提取回收率和基质效应 按2.4项下方法配置低、中、高3个质量浓度的质控样品，每个浓度样本平行6份，按2.5项下质谱和色谱条件测定，得各成分峰面積A；取200 μL空白血浆按2.2项 下处理后，改用低、中、高3个浓度的混合对照品溶液复溶，每个浓度样本平行6份，按2.5项下质谱和色谱条件测定，得各成分峰面积B；取相同浓度的混合对照品溶液，按2.5项下质谱和色谱条件测定，所得的色谱峰面积为C。提取回收率=A/B×100%，样品的基质效应=B/C×100%。
2.6.5 稳定性实验 按2.4项下方法配置低、中、高3个质量浓度的质控样品，分别在在室温放置6，12 h，考察样品的短期稳定性；-20 ℃下反复冻融3次，考察样品冻融的稳定性；-20 ℃下冷藏4周考察样品的长期稳定性。计算结果以相对标准偏差（RSD）表示。经测定在4种情况下得到的7种化合物的峰面积与零时间点的RSD均在15%以内，提示实验条件下血浆样品稳定性良好。
2.6.6 大鼠口服银丹心脑通软胶囊后血浆中7种化合物药代动力学研究 大鼠灌胃给予银丹心脑通软胶囊后，采用UPLC-MS/MS测定血浆中7种化合物的浓度，将大鼠血浆药物浓度作为纵坐标（concentration）和时间作为横坐标（time）作图，获得大鼠口服银丹心脑通软胶囊后7种主要成分的平均血药浓度-时间曲线。
在DAS 2.1.1软件中输入所测得的7种化合物在各时间点的血药浓度，采用统计矩方法拟合可获得药代动力学参数。以药物半衰期（t1/2）、达峰浓度（Cmax）、达峰时间（tmax）和药-时曲线下面积（area under the time-concentration curve，AUC）等参数表征该药物的药动学特征。
3 结果
3.1 专属性考察
空白血浆、空白血浆加混合对照品以及给药后所得血浆样品色谱图见图2，QCT，ISR，KMF，GA，GB，GC，BB及内标物IS保留时间分别为2.433，2.582，2.557，2.497，2.494，2.323，2.454，2.611 min。经考察7种待测化合物和内标化合物均不受内源性物质的干扰，方法特异性良好，适用于7种成分的含量测定。
3.2 标准曲线及线性范围
以QCT，ISR，KMF，GA，GB，GC，BB浓度为横坐标，以7种成分与内标峰面积比值为纵坐标，以加权最小二乘法进行线性回归运算，得标准曲线、相关系 数、线性范围及定量限见表2。结果表明，7种成分在1～100 μg·L-1线性关系良好，定量下限为1 μg·L-1（S/N≥10），表明该方法灵敏度较高，可用于7种成分的微量分析。血浆中7种化合物的标准曲线、相关系数、线性范围及定量限见表2。
3.3 日内、日间精密度和准确度实验
精密度和准确度结果见表3，结果表明，7种化合物的日内精密度RSD均小于9.9%，日间精密度RSD均小于11%，准确度为92.27%～107.5%，结果均符合生物样品分析方法指导原则的要求。
3.4 基质效应及回收率试验
基质效应及回收率结果见表4，结果表明，7种成分低、中、高3个浓度提取回收率在76.86%～95.77%，且RSD均小于11%，符合生物样品分析要求。基质效应测定结果表明，7种成分低、中、高3个浓度机制效应为94.25%～103.3%，且RSD均小于12%，基质效应及回收率实验表明该方法提取回收率较高，无内源性成分干扰，符合生物样品的分析方法的要求。
3.5 稳定性试验
稳定性实验结果表明，7种质控样品室温放置6，12 h，-20 ℃反复冻存和-20 ℃长期冻存后基本稳定，其RSD均在11%以下，符合生物样品测定要求，见表5。
3.6 药代动力学试验
大鼠灌胃给予银丹心脑通软胶囊后，采用建立的UPLC-MS/MS方法测定各时间点血药浓度，7种化合物在大鼠体内的平均药-时曲线见图3，血药浓度数据采用DAS 2.1.1软件进行计算，以药物半衰 期（t1/2）、达峰浓度（Cmax）、达峰时间（tmax）和药-时曲线下面积（area under the time-concentration curve，AUC）等参数表征该药物的药动学特征，见表6。结果显示大鼠给药后5 min在血中可以检测到7种成分，从达峰时间来看，槲皮素、山柰酚和异鼠李素达峰时间较快，分别为0.33，0.5，0.33 h，其次为银杏内酯A（0.75 h）、白果内酯（0.75 h）、银杏内酯B（1.0 h）、银杏内酯C（1.5 h）。从半衰期看，槲皮素、银杏内酯C、白果内酯半衰期较短，分别为2.69，5.45，5.55 h，其次为银杏内酯A（7.52 h）、银杏内酯B（7.84 h）、异鼠李素（8.19 h）、山柰酚半衰期最常（10.48 h）。从体内暴露程度量来看，银杏内酯B在大鼠血浆中AUC最大，说明银杏内酯B具有较好的生物利用度。从平均血药浓度-时间曲线可以看出，3种黄酮类成分存在明显的双峰现象。口服银丹心脑通软胶囊后，黄酮类成分达峰时间快，在体内滞留时间较长，消除较慢；而银杏内酯类成分达峰时间较慢，半衰期较黄酮类时间短，体内滞留时间短，消除快。
4 讨论
银丹心脑通软胶囊口服后，体内的槲皮素、山柰酚和异鼠李素药-时曲线存在明显的双峰，表明这3种成分在体内可能通过肝肠循环进行重吸收，这与文献中报道的一致[12-13]，这将增加和维持银丹心脑通软胶囊3种成分在体内较高的血药浓度，是药物作用的持续时间延长。
黄酮类成分tmax均在0.5 h以内，说明银丹心脑通软胶囊中黄酮类成分能被迅速地吸收，这可能与其较大的脂溶性，易透过细胞膜有关。银杏内酯类成分tmax均在0.75 h以上，在体内吸收较慢。槲皮素和银杏内酯类成分MRT和t1/2均在10.58 h以内，说明单次给药后，在体内消除较快，不易在体内产生残留和蓄积。而山柰酚和异鼠李素MRT均超过13.91 h，在体内消除较慢，且两种成分均出现双峰，因此每日3次服用药物有助于维持稳态血药浓度。血浆中7种成分依据药代动力学参数Cmax的平均值排序为GB>GA>KMF>BB>QCT>GC>ISR；AUC0–t的平均值排序为GB>GA>QCT>KMF>BB>ISR>GC；t1/2的平均值排序为KMF>ISR>GB>GA>BB>GC>QCT。由此可见，GB的Cmax和AUC0–t最大，而t1/2相对较小，说明GB被吸收入血的量最多，并能被很快消除。研究表明GB是银杏内酯类化合物中抑制血小板活化最强的一种，并且已经被开发为银杏内酯B注射液在临床用于治疗心脑血管疾病[14-15]。
綜上，本文建立了一种简便、快速且灵敏度高的UPLC-MS/MS测定方法，样品处理方法简单，能同时检测出银丹心脑通软胶囊中7种成分的含量，适用于银丹心脑通软胶囊的药代动力学研究。通过药代动力学研究，了解银丹心脑通软胶囊中7种主要成分在体内的暴露，有利于更精确地研究这些成分的药效作用，并为阐明银丹心脑通软胶囊体内药效物质基础和安全合理用药提供了科学依据。
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[责任编辑 吕冬梅]