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摘要：为研究KLF5的相互作用蛋白从而深入探索其生物功能，构建了C端带有FLAG、HA、6xHis三标签的pOZ-KLF5真核表达逆转录病毒栽体。pOZ-KLF5栽体可通过一次转录得到双顺反子转录单位，即一个转录物能表达两种独立存在的蛋白质：三标签融合蛋白KLF5-3xTag和筛选标记——白细胞介素-2受体a（IL-2Ra）。通过偶联IL-2Ra抗体的磁珠成功筛选出KLF5-3xTag表达阳性的293T细胞，经Western-blot检测细胞内KLF5-3xTag表达情况及其对293T细胞增殖及周期的影响，发现KLF5-3xTag能够促进细胞克隆的形成并使S期细胞增多，且可被已知E3泛素连接酶WWP1降解，与已有报道一致。进一步通过免疫沉淀实验证明了与KLF5融合的标签的免疫反应性。该质粒的成功构建为研究KLF5相互作用蛋白及深入探索其生物功能奠定了基础。关键词：KLF5；双顺反子转录；真核表达；三标签融合蛋白中图分类号：Q812文献标识码：A文章编号：1007-7847（2015）02-0124-07Construction and Characterizations of pOZ-KLF5 Retroviral PlasmidZHAO Xin-yu， WANG Wei-xi， LU Ze-lan， HUANG Lei， ZHAO Ke-wen*（Department of Pathophysiology， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine， Shanghai 200025， China）Abstract： To analyze KLF5 interacting proteins and explore the biological functions of KLF5， the eukaryotic expression retroviral plasmid pOZ-KLF5， with the FLAG， HA， 6xHis triple tags at C-terminal， was con¬structed. Plasmid pOZ-KLF5 can get a bicistronic transcription unit after once transcription and express two independent proteins： triple-tagged fusion protein KLF5-3xTag and selection marker interleukin-2 receptor a （IL-2Ra）. 293T cells expressing KLF5-3xTag were successfully selected by the magnetic beads coupling IL-2Ra antibody， and the expression of KLF5-3xTag was detected by Western-blot. Then， the proliferation and cell cycle of 293T were tested， and the results indicated that KLF5-3xTag promotes the proliferation of cell colonies and the Gl/S transition.In addition， co-expression of WWP1， a known E3 ligase of KLF5， can decrease KLF5-3xTag protein level， which is consistent with previous reports. Furthermore， immunoprecipi- tation experiment was applied to prove the immunoreaction of the tags. The successful construction of pOZ- KLF5 provides a powerful tool to study the interacting proteins of KLF5 and to explore the biological func¬tions of KLF5.Key words： KLF5； bicistronic transcription； eukaryotic expression； triple-tagged fusion protein（Life Science Research， 2015， 19（2）： 124〜130）KLF5蛋白是类KtlippeKKriippel-likefactors，KLF）转录因子家族的一员，属于基础转录因子。到冃前为止该家族巳经有17个成员被鉴定出来。KLF5又名BETB2（basictranscriptionelement-bindingprotein2）和IKLF（intestine-eichedKriippel-likefactor），在胚胎发育、细胞周期、细胞生长与分化、维持细胞干性等生物过程中发挥作用。研究发现KLF5在人和小鼠的小肠、结肠、胃、胰腺、胎盘、睾丸、骨骼肌、肺、膀胱和子宫等组织中广泛表达[1-3]。KLF5能与多个基因的GCbox区域结合从而调控其转录。KLF5蛋白C端含有KLFs家族特征性的、可以结合基因组DNA的3个串联重复的锌指（zincfinger，ZF）结构域，在ZF结构域前含有富含脯氨酸的转录激活结构域。值得关注的是，KLF5在不同的细胞类型中发挥的作用不同，已有的研究提示这可能与KLF5的翻译后修饰有关。KLF5蛋白有不同的翻译后修饰，包括磷酸化、乙酰化、泛素化和SUMO化修饰，经过翻译后修饰的KLF5可以与不同的蛋白相互作用从而发挥不同甚至完全相反的功能[4.5]。为了研究KLF5在真核生物不同生理及病理条件下的相互作用蛋A从而深入研究其生物学功能，我们构建了逆转录病毒真核表达载体P0Z-KLF5，通过磁珠筛选出阳性克隆，在检测KLF5生物功能的同时，验证了与目的蛋白KLF5融合的标签的免疫反应性。1材料与方法1.1材料大肠杆菌DH5a感受态（Invitrogen，美国），pOZ-C载体[6]（简称pOZ，C端带有FLAG和HA标签，Addgene，美国），质粒提取试剂盒（QIAGEN，美国），凝胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒（Tian-gen，中国），XhoⅠ、NotI核酸内切酶、T4DNA连接酶（Takara，日本），LB培养基（Oxoid，英国），X-tremeGENE9转染试剂（Roche，美国），MG132（Sig-ma，美国），抗FLAG-M2亲和凝胶、抗HA亲和凝胶（Sigma，美国），抗IL-2Ra抗体（Upstate，美国），Ni-NTA琼脂糖（QIAGEN，美国），DynabeadsM450（Invitrogen，美国），抗KLF5抗体（Protein-Tecli，美国）c1.2pOZ-KLF5表达载体的构建根据逆转录病毒载体pOZ的多克隆位点，设计带有XhoI和NotI酶切位点（见斜体）的KLF5扩增引物，在C端PCR引物中引人了6xHis标签（见下划线）。引物序列Forward：5’（-GGGCrCGAGTGCCACCATGGCTACAAGGG-TGCTGAGC-3’， Reverse5’-CCCGCGGCGGCQI-GGTGGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGCCTCTTCA-TATG-3"。以人KLF5的CDNA为模板，PCR扩增C末端带有6xHis标签的KLF5基因’命名为ALF5-6xHis。PCR条件如下：94℃变性3min，94°C 30s，55℃30s，72℃1min，30个循环，72℃；延伸10min，4℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶回收试剂盒回收PCR产物，然后分别用XhoI和I酶切PCR产物和P0Z-C载体，用胶回收试剂盒回收酶切后的AXF5片段与载体，用T4DNA连接酶将KLF5-6xHis与pOZ载体连接，转化感受态DH5a，挑选阳性克隆于3mL的LB培养基小量扩增，并用质粒提取试剂盒提取所构建的质粒。经XhoI和NotⅠ酶切确定目的片段的插入，测序证实插入载体目的片段的正确性，质粒被命名为P0Z-KLF5。1.3稳定表达pOZ-KLF5质粒的细胞系筛选采用Roc.he公司的X-tremeGENE9试剂将逆转录病毒载体P0Z-KLF5连同病毒包装辅助质粒gag-Pol、VSV-g—起转染包装细胞，48h后收集具有感染能力的逆转录病毒感染293T细胞，由于P0Z-KLF5质粒可以同时转录并表达两种蛋白质：目的蛋白KLF5和筛选标记白细胞介素-2受体a（IL-2Ra），因此可以通过偶联IL-2Ra抗体的DynabeadsM450磁珠筛选pOZ-KI，F5病毒感染的293T细胞，从而得到稳定表达三标签融合的目的蛋白KLF5（简称KLF5-3xTag）的293T细胞系。1.4pOZ-KLF5质粒在真核细胞表达的鉴定收集1.3中获得的稳定表达KLF5-3xTag的293T细胞的总蛋白，WestemBlot方法检测目的蛋白KLF5-3xTag的表达情况。1.5细胞水平检测KLF5的生物学功能使用1.3中获得的稳定表达KLF5-3xTag的293T细胞进行克隆形成实验和细胞周期分析实验，检测KLF5-3xTag蛋白的表达对细胞增殖及细胞周期的影响。克隆形成实验分别将100个1.3筛选的对照组和KLF5-3xTag表达组293T细胞接种到六孔板中培养10d，吸去上清液，用PBS洗两遍，冰甲醇固定细胞后结晶紫染色，晾干后拍照，并对直径超过100μm的克隆进行统计分析。使用同样的对照组与KLF5-3xTag表达组293T细胞检测细胞周期：分别离心收集lxlO6个细胞，用PBS洗两遍后，加入预冷70%乙醇于-20°C固定过夜，第二天用PBS洗两遍，加入PI染料和RNaseA于37℃避光孵育30min，最后用流式细胞仪检测周期。1.6Western-blot检测WWP1对KLF5-3xTag蛋白的降解在1.3中获得的稳定表达KLF5-3xTag的293T细胞内共转染WWP1质粒（美国Emory大学DrnigJT教授惠赠）或者对照载体，收集细胞前4h加入20μmol/LMG132处理，收集细胞总蛋白Westem-blot检测细胞中KLF5蛋白的含量变化，β-actin作为内参。1.7pOZ-KLF5质粒所带标签的免疫反应性将1.3中获得的稳定表达KLF5-3xTag的293T细胞与对照组细胞收集蛋白后分别选用抗FLAG-M2亲和凝胶、抗HA亲和凝胶、Ni-NTA琼脂糖进行免疫沉淀（IP）实验，然后通过Westernblot实验来验证KLF5-3xTag蛋白所带标签的免疫反应性。2结果2.1pOZ-KLF5表达载体的构建与鉴定根据pOZ载体的多克隆位点，选择XhoI和NotI两个限制性内切酶位点分别加入KLF5上游和下游PCR引物中；考虑到相互作用蛋白研究需要纯化出大量且高纯度的蛋白，我们在C端PCR引物中引入了6xHis标签，为以后的多步骤纯化提供多种选择。以人的KLF5cDNA为模板，PCR扩增KLF5基因编码区，获得1392bp（l374bp的编码区+18bp的6xHis标签）目的片段KLF5-6xHiso将经过XhoI和NotI限制性核酸内切酶酶切的KLF5-6xhis与pOZ载体加入T4-DNA连接酶经过16T连接过夜，转化DH5a感受态涂板，然后随机挑取4个克隆于3mL的LB培养基中振荡培养过夜，抽取质粒后经琼脂糖凝胶电泳鉴定全部为阳性。将阳性克隆摇菌抽提后所得的质粒命名为P0Z-KLF5（详见材料方法1.2）。POZ-KLF5质粒用XhoI和NotI双酶切后琼脂糖凝胶电泳再次确定目的片段的插入。pOZ-KLF5质粒双酶切后在1392bp处出现目的条带，与KLF5-6xHis基因大小一致（如图1箭头所示）。P0Z-KLF5质粒经DNA测序后与基因库中的序列完全一致，且6xHis标签序列也准确地插入目的片段KLF5的C末端。2.2稳定表达KLF5-3xTag细胞系筛选和检测将阴性对照pOZ与P0Z-KLF5分别1f病毒包装辅助质粒一起转染包装细胞，然后收集pOZ、P0Z-KLF5逆转录病毒并分别感染293T细胞。病毒感染48h后经偶联IL-2Rα抗体的DynabeadsM450磁珠筛选出稳定表达KLF5-3XTag蛋白的阳性细胞（见材料与方法1.3），感染pOZ逆转录病毒的293T细胞作为对照组细胞。收取细胞总蛋白Western-blot分析KLF5-3xTag蛋白表达情况，抗KLF5的抗体可以检测到KLF5-3xTag蛋白的高效表达（KLF5-3xTag条带；Endo.KLF5为内源性KLF5蛋白），如图2所示。2.3KLF5-3xTag生物学功能及蛋白降解检测为验证所构质粒表达产物KLF5-3xTag的功 能Q已知的KLF5生物功能一致，我们将2.2得到的稳定表达KLF5-3xTag的293T细胞进行克隆形成实验以及细胞周期分析（见材料与方法1.5）。克隆形成实验结果显示，尽管总的细胞克隆数并没有太大变化，KLF5-3xTag表达的293T细胞与对照组比较其形成的细胞克隆更大。对直径达到100μm的细胞克隆数目进行统计后发现KLF5-3xTag表达组比对照组形成100以上大克隆的数目明显增多（p=0.0131）（图3）。流式细胞仪对其细胞周期的分析结果显示：KLF5-3xTag表达组处于G0/G1期的细胞比例均值为61.43%，与对照组的62.025%并无太大差别，但KLF5-3xTag的表达使处于S期的细胞比例达到18.82%，比对照组（14.28%）增加约35%；同时，KLF5-3xTag表达组处于G2/M期的细胞比例为20.26%，比对照组（24.1%）下降了约17%（图4），并且实验结果可重复。以上结果表明KLF5-3xTag的表达促进了细胞的增殖：使处于S期的293T细胞比例增多，促使单个细胞形成的克隆体积更大，与以前的报道一致[7、8]。已有文献报道，KLF5属于半衰期较短的不稳定蛋白，可以被多种E3泛素连接酶修饰而经蛋白酶体途径降解，并且N端加入标签可以影响KLK5蛋白的降解[9、10]，因此我们将融合标签加入到KLF5蛋白的C端，为了验证C端标签的插入并不影响KlT5-3xTag蛋白的降解，我们在稳定表达KLF5-3xTag的293T细胞中转染KLF5已知的E3泛素连接酶WWP1（见材料与方法1.6），结果如图5所示，KLF5-3xTag与内源KLF5—样能够被WWP1所降解，而加入蛋白酶体抑制剂MG132可以稳定KLF5-3xTag蛋白。由此验证了C端标签的加入并未对KLF5蛋白降解产生影响。2.4pOZ-KLF5质粒所带标签的免疫反应性验证裂解2.2得到的稳定表达KLF5-3xTag的293T细胞，收取总蛋白后分别用抗HA亲和凝胶、Ni-NTA琼脂糖、抗FLAG-M2亲和凝胶进行免疫沉淀实验，Western-blot分析KLF5_3xTag所带标签是否可以有效沉淀KLF5_3xTag。Ni-NTA琼脂糖、抗HA亲和凝胶、抗FLAG-M2亲和凝胶均可以通过与KLF5融合的6xHis、HA（图6A）、FLAG（图6B）标签有效结合而免疫沉淀KLF5蛋白。同时为了检测标签免疫沉淀的效果，在稳定表达KLF5-3xTag的293T细胞中共转染了KLF5已知的相互作用蛋白WWP1，经MG132处理后用抗FLAG-M2亲和凝胶沉淀下KLF5蛋白的同时也可以在免疫沉淀复合物中检测到WWP1蛋白（图6B）。由此可见，KLF5所带标签均具有良好的免疫反应性且未互相影响，并且标签可以有效免疫沉淀KLF5的相互作用蛋白。因此KLF5-3xTag可以作为寻找KLF5在特定生理、病理条件下的相互作用蛋內从而深入探索KLF5功能的有力工具。3讨论KLF5作为转录因子通过调控许多下游基因的表达在胚胎发育、炎症反应、心血管发生、肿瘤生长等过程中发挥重要生物学功能。已有研究表明，在不同细胞环境下，KLF5可以发挥截然不同的作用[11]；在上皮细胞的分化过程，表皮基底细胞和培养的非肿瘤上皮细胞中，KLF5刺激细胞增殖在多种肿瘤细胞系和TGFβ信号通路活化的非肿瘤上皮细胞中抑制细胞增殖[12-15]。与其在细胞增殖方面的双重功能一致的是，KLF5在肿瘤形成过程中可以发挥癌基因[19]和肿瘤抑制双重功能：很多报道显示KLF5在多种癌症中表达上升并与乳腺癌病人的低生存率有关[20、21]，表明KLF5发挥癌基因的作用；另有研究表明在乳腺癌和前列腺癌中KLF5基因失活[22-24]。在胃癌中KLF5表达是良性特征并与病人的高生存率有关表明KLF5是潜在的肿瘤抑制因子。KLF5存在多种翻译后修饰，翻译后修饰可以调控KLF5蛋内的稳定性或改变其相互作用的蛋白从而影响甚至逆转KLF5的功能：比如FBW7、WWP1、EFP、SMAD等可以通过影响KLF5的泛素化而影响其蛋白的稳定性1%271；PKC、MEK/ERK、P38、GSK3β[28、29]等信号通路通过影响KLF5的磷酸化而改变KLF5的转录活性或者蛋白稳定性[30、31]；p300、SET、HDAC等通过改变KLF5的乙酰化影响KLF5的生物功能[32、33]。由于转录因子在染色体DNA上可以通过与服务于不同转录机制的多种蛋白形成转录因子复合物调控相关基因表达，在不同环境刺激因子作用下，KLF5发生不同的翻译后修饰改变了其蛋白构象从而改变其转录因子复合物的组成，使KLF5可以对同样的一组靶基因产生完全不同的调控作用或者调控功能相反的靶基因转录。因此研究这些可以与KLF5相互作用的蛋白具有非常重要的意义。
为了研究KLF5的相互作用蛋白从而深入探索KLF5的生物学功能，构建了真核表达的逆转录病毒质粒pOZ-KLF5。通过此质粒的构建，能够为将来研究与KLF5相互作用的蛋白、从而为进一步研究KLF5的翻译后修饰及其对KLF5生物学功能的影响提供了新的工具。pOZ载体是逆转录病毒载体，可以通过感染获得目的蛋白的高效表达。pOZ载体自身带有FLAG和HA标签，根据标签与目的基因融合的位置不同，分为pOZ-N（标签在目的蛋白N末端）与pOZ-C（标签在目的蛋白C末端）两种。已有报道显示，N端的氨基酸序列对KLF5功能非常重要，并且N端融合标签的加入可能影响KLF5的稳定性[34、35]。因此选择了pOZ-C载体构建P0Z-KLF5质粒。由于相互作用蛋白的分析通常联合蛋白质谱的鉴定，因此需要纯化出大量的目的蛋白化合物，为了降低实验成本，在KLF5编码区C端加入了6xHis标签，这样可以通过成本较经济的Ni-NTA琼脂糖进行后续实验。同时，相互作用蛋白的分析通常需要进行多步骤亲和层析从而减少非特异性的相互作用蛋白并降低假阳性的产生，pOZ-KLF5质粒通过3种标签蛋白（6xHis，FLAG，HA）的表达，为以后鉴定KLF5相互作用蛋白提供了多种标签的选择，并且这些标签全部位于C未端，避免了对KLF5本身可能造成的结构、功能上的影响pOZ-KLF5质粒可以同时表达冃的蛋白KLF5-3xTag和筛选标记IL-2Ra，通过偶联lL-2Ra抗体的DynabeadsM450磁珠进行筛选得到稳定表达Kl.F5-3xTiig蛋白的阳性细胞。这种筛选方法避免了抗生素筛选对细胞的损伤并提高广筛选的效率，然后通过Western-hlot实验证明KLF5-3xTag的表达，如图2所示，此外，可以通过3个融合标签经多步骤的亲和层析分离纯化出与KLF5特异性相互作用的蛋白，从而为深入研究KLF5的生物学功能打下基础。将获得的P0Z-KLF5表达阳性细胞进行流式细胞分析和克隆形成实验，对KLF5-3xTag表达的293T的细胞周期和细胞增殖情况进行了检测；结果显示，KLF5-3xTag表达的293T细胞使处于细胞周期S期的细胞比例明显增加（14.28%vs.18.82%），而S期增多是细胞处于旺盛分裂期的标志。此外，克隆形成实验结果显示，虽然形成的克降数目无明显改变，但是KLF5-3xTag表达的细胞形成的克降直径更大，说明KLF5-3xTag表达使单个细胞的增殖能力增强。通过CCK8分析检测细胞生长曲线，并没有观察到KLF5-3xTag表达对生长产生明显影响，可能是由于293T是永生化的作恶性转化的细胞，与报道的恶性增殖的肿瘤细胞存在细胞背景及信号通路等差异[36-38]，但KLF5确实对293T细胞的增殖有一定的促进作用KLF5属于半衰期较短的不稳定蛋白，在体内主要被多种E3泛素连接酶泛素化并通过蛋白酶体途径降解，WWP1是最先被报道的可以降解KLF5蛋白的E3泛素连接酶[39]。报道显示，WWP1能通过与KLF5的PY结构相互作用从而泛素化并降解KLF5蛋白[40]，之前报道在KLF5蛋白N端插入标签会影响WWP1对KLF5的降解，所以我们构建的P0Z-KLF5质粒所带标签都位于KLF5蛋白的C端，并且通过实验证明标签不影响WWP1对KLF5蛋白的降解（图5）。为了验证KLF5所带标签的免疫反应性，用KLF5-3xTag蛋白所带3种不同的标签分别进行免疫沉淀实验，验证了KLF5所带的标签均可以成功免疫沉淀KLF5蛋白，并且在免疫沉淀的复合物中我们还成功检测到了已知与KLF5相互作用的蛋白WWP1（图6），证明了P0Z-KLF5质粒所带标签均具有很好的免疫反应性，可以作为研究KLF5相互作用蛋白进而深入研究KLF5功能的有力工具。通过一系列的实验，证明了pOZ-KLF5质粒C末端所带的3个标签能够分别发挥效应，成功地免疫沉淀KLF5蛋内，并可以检测到已知的KLF5相互作用蛋白。生物学功能的检测也发现KLF5-3xTag的功能与之前报道一致，且C末端所带标签对KLF5的降解并无影响：因此，该质粒的构建能够更加方便在特定的病理生理条件下分析KLF5的相互作用蛋白，为深入研究KLF5的生物功能奠定基础。参考文献（References）：[1]DONG J T， CHEN C. 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