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摘 要 为促进地方城市高校生命科学学院本科学生建立培养细胞、制备细胞、改造细胞以及基因/细胞治疗的现代生物知识体系和技术水平，锻炼实验思维和提升科学素养，广州大学生命科学学院开设细胞生物学理论与实验一体化教学，从教学的主导思想、实验内容、教学形式等方面进行一系列改革创新。具体以细胞原代培养实验为实验案例，探讨实验细胞生物课的课程改革情况。
关键词 细胞生物学实验;动物细胞原代培养;实验教学;素质教育;相差显微镜;实验室
中图分类号：G642.423 文献标识码：B
文章编号：1671-489X（2018）18-0111-03
1 前言
细胞培养技术是生物学、医学、药学研究以及细胞治疗过程中普遍应用的手段，已广泛应用于生命科学、基因工程、细胞工程、基因/细胞治疗等重要基础研究及临床领域，是加强学习细胞生物学理论课程知识的重要途径[1]。为了本科学生深入认识细胞，培养利用细胞、改造细胞的现代细胞知识框架和技术体系，广州大学生命科学学院开设细胞生物学实验课程，课时为36学时，细胞原代培养实验（12学时）贯穿理论和实验教学始终。广州大学原为广州市属高校，地处广东省会广州市，历史悠久。随着2015年晋升为一本院校，学院规模设备等充实扩大，研究实验经费充足，与广州中医药大学、广东药科大学同设大学城校区，校际交流紧密，也为进一步提升细胞生物学实验课程教学质量提供了坚实基础和丰富经验。
2 以素质教育为主，着重创新为主导思想
课程结合翟中和主编的《细胞生物学》（第四版，高等教育出版社）与杨汉民主编的《细胞生物学实验》（第二版，高等教育出版社），教育学生以批判接受眼光学习前辈科研成果，启发学生科学探索的思路和方法，鼓励学生敢于创新思维，打破常规，做出合理实验假设。同时，宣讲生物伦理学和善待实验动物的态度与法规，引导学生合理运用科学技术，培养一批守法合规的科研工作者。
细胞培养技术的介绍能使学生对该技术领域有整体认识，了解仪器、方法、材料，熟悉细胞体外生长、代谢规律及影响因素[2]。细胞培养技术包括细胞原代培养和细胞传代培养。原代培养直接由体内取出组织或细胞进行培养，由于其离体时间短，性状与体内较相似，适用于研究。传代培养指把体外培养的原代细胞或细胞株，当细胞生长至高密度时，分殖至新的培养瓶中传代，以期获得大量同种细胞或稳定的细胞株，延续细胞种[3]。下面以原代细胞培养的学生实验为教学案例进行详述。
实验方法：细胞分离及原代培养
1）植块培养法。取1～3日龄的大鼠乳鼠[4]，浸入75%乙醇约15分钟处死，取出放在大平皿;在超净工作台内剪开皮肤，剖开腹腔取出需要的组织器官，置于冰冷小平皿;用PBS清洗血液，以锐剪刀修理，去除脂肪和筋膜，移到另一无菌烧杯中;剪成1 mm3小块后，再次清洗并移入青霉素瓶中;加入胰蛋白酶1 mL，37 ℃慢速振荡15分钟，弃去上清液;再把组织块接种到培养瓶中，共10～15块，间距0.2～0.5 cm;轻翻转培养瓶，添含胎牛血清的DMEM培养液10 mL[5];盖好瓶塞，用封口胶封住，放入CO2培养箱中培养;隔2～4小时后，待小块贴附后，将培养瓶缓慢转平放，继续培养;隔24小时更换培养液，再倒置培养瓶，不贴壁的组织块取出，贴壁组织继续培养;培养3～5天后可换液，补充营养，用倒置显微镜观察实验结果[6]。
2）单细胞培养法（酶解法）取组织的方法同上，取出后把器官放入青霉素瓶中;用PBS缓冲液清洗，剪碎，加入适量的胰蛋白酶，以盖住细胞为宜;保持37 ℃摇匀1～2分钟，注入含胎牛血清的DMEM培养液终止消化;静置2分钟后，弃去上清液，注入2 mL培养液;用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液;吸出细胞悬液分装至2～3个培养瓶中，加入适量培养基后旋紧瓶盖;置于倒置显微镜下观察细胞数量，必要时可使用细胞计数法计数;用酒精棉球擦拭培养瓶后，适当旋松瓶盖，置于CO2培养箱中繼续培养[7]。细胞培养2小时后开始贴附在瓶壁上，当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积75%时记为+++，占50%时记为++，占25%时记为+。
3）机械解离法以之前相同方法处死小鼠，用解剖剪剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠的脾脏;在直径60 mm培养皿中注入EZ-Sep™ Mouse 1X淋巴细胞分离液4～5 mL，不锈钢筛网盖在培养皿上;用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过不锈钢筛网进入淋巴细胞分离液中;把含有脾脏细胞的分离液转移到培养瓶中，加入RPMI 1640培养基1 mL[8]，放入CO2培养箱中培养[9]。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积75%时记为+++，占50%时记为++，占25%时记为+。
结果
1）植块培养法实验结果如图1A、图1B、图1C所示，观察到较多的细胞从组织块溢出，细胞数目较多。该法是一种操作简易、成功率高的细胞原代细胞培养法，大约30%的学生采用此法，成功率较高。
2）单细胞培养法的实验结果如图2A、图2B所示，能看到较清晰的贴壁细胞，细胞分布均匀。图2A细胞数目较多，记作+++;图2B细胞数目较少，记作++。该法也是比较常用的原代细胞培养法。
3）机械培养法的实验结果如图3A、图3B所示，能看到较清晰的悬浮的淋巴细胞，圆球形，细胞数目较多，占视野的75%，记作+++。该法常用作悬浮细胞的培养法。
讨论 综上，植块培养法、单细胞培养法、机械培养法都是学生实验常用的原代细胞培养法。其中植块培养法是成功率最高，可选材料部位多，操作最简单的培养方法，翻转培养瓶，以组织块贴壁不掉落为成功。单细胞培养法培养效果好，需掐准酶解时间，防止消化不足或取材不够，消化过度、细胞失活的情况发生。第三种机械培养法操作较前两种方法稍复杂，取材部位有局限，较常用作实质器官细胞培养。
在教学进程中，针对学生观察乳鼠中不同部位细胞的形态结构、组织粘连性的需要，组织学生分组实验。每组采用一种取样方法取同一部位，多组实验结果记录在案，由学生完成并记录对比数据，摸索最佳实验效果，共享实验成果。
3 教学管理双管齐下，重视技能训练
细胞培养实验是细胞生物学基础实验，准备时间长，实验耗材大，实验要求高，实验流程紧。实验流程包括前期灭菌消毒→实验材料乳鼠养殖→实验过程取材→细胞培养监控→形态学显微观察与记录→实验总结和汇报。建立周汇报制度：学生代表每周汇报并检查进程，加强师生互动交流，促进教学进程。建立实验室值班制度：每班一把钥匙，交由学生组长轮流值日检查。建立仪器使用登记制
度：学生使用大型贵重仪器（如相差显微镜）需登记使用日期、人员、使用情况。培养学生自主管理、独立完成、爱护仪器、清洁卫生的习惯，全面提高学生实验素养和技能。
4 创新教学形式，激发学生兴趣
开放式课堂[10] 该课程发展日新月异，为了使学生更充分地接触前沿知识，开阔领域思路，课堂组织形式以讲授教材为主，但不局限于教材和课堂教学，理论教学以章节为单位，集文字、动画、图像、教学视频于一体，有机组合教学资料[7];课后组织学生搜集细胞工程、试管婴儿、人造器官等话题材料，制作宣传海报等作业形式;课余邀请外院客座教授讲座，满足学生直观感悟和理性认识。
开放式讨论 生物领域充满未知和探索，开设每周一题、每周一例、每周一汇，引导学生针对前沿概念、诺贝尔生理学和医学奖案例、实验所遇问题等进行讨论分析，教师认真听取学生意见，给予参考思路或建议。
开放式实验 在实验课堂中，师生角色发生改变，转变传统课堂教学以教师为中心、学生被动接受知识的局面，实验以学生为主，教师角色从主体变为主导，从旁指导。在同学协助下，学生动手完成实验[11]。鼓励学生利用课余时间，充分利用校内外资源，参加创新大赛和“挑战杯”，组队完成开放型实验课题，如探索有趣实验现象，简化原有实验工作步骤等。
5 结语
细胞生物学是广州大学生命科学学院本科生的基础必修课程，其课程改革有利于培养创新型、实用型本科人才。本文以动物细胞原代培养实验为例，介绍学院如何从以素质教学为主、着重创新培养的主导思想入手，辅以教学管理，注重技能培训的教学内容革新，创新教学形式，激发学生兴趣，全面改革细胞生物学课程。实践证明，改革有助于提升学生的科学素养和实验技能，出色地完成生物医药本科人才培养计划。
参考文献
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