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摘要：为快速、灵敏并且特异性地检测红枣中链格孢菌，选取2对链格孢菌特异引物，优化多重PCR检测中的引物比例、退火温度、dNTP浓度及Mg2+浓度等条件，结果表明多重PCR扩增出了预计的链格孢菌PCR产物，优化的条件为Alt-F2＼R2 ∶Alt-F1＼R1=3 ∶1、退火温度52 ℃、dNTP浓度0.05 mmol/L、Mg2+浓度1.5 mmol/L。该方法在检测红枣链格孢菌中具有很好的应用和开发前景。
关键词：红枣；链格孢菌；多重PCR；检测
中图分类号： TS207.4 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）09-0301-02
红枣（Zizyphus jujuba Mill.）是集营养、保健于一体的优质干果，含有丰富的多糖、维生素C、黄酮、cAMP等成分[1-2]，但红枣在自然条件下贮藏容易发生真菌病害侵染引起的霉变，在霉变过程中，真菌产生的二次代谢产物真菌毒素具有很强的毒性，会给食用者带来危害[3-4]。近年来的研究表明，链格孢菌是红枣霉变中的主要真菌之一[5-7]，因此对其进行快速准确地检测，对控制红枣产品的安全性具有重要意义。
多重PCR检测技术具有快速、简便且特异性的优点，在许多植物真菌的检测中得到广泛应用[8-10]，但对枣中链格孢菌的多重PCR检测尚未见报道。本研究针对枣中链格孢菌特菌Alt-F1＼R1扩增片段和Alt-F2＼R2扩增片段设计引物，采用多重PCR对其进行鉴定，研究其多重PCR检测条件，旨在为枣产品的链格孢菌检测提供一种新方法。
1 材料与方法
1.1 材料
Tap酶、dNTP，均购自TaKaRa公司；真菌DNA提取试剂盒，Omega公司；5311型PCR仪，德国Eppendorf公司；LPH恒温培养箱，上海鸿都电子科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 病原真菌总DNA的提取 将霉变红枣上刮下的菌丝洗涤、干燥，液氮研磨后转移至EP管中，使用试剂盒提取基因组DNA作为PCR反应的模板，0.8%琼脂糖凝胶电泳法检测DNA。
1.2.2 链格孢菌引物单重PCR特异性试验 根据序列比对结果，选取2对链格孢菌的特异引物：
Alt-F1：5′-TGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCT-3′；
Alt-R1：5′-CGACTTGTGCTGCGCTC-3′；
Alt-F2：5′-CTTTTGCGTACTTCTTGTTTCC-3′；
Alt-R2：5′-CAGGCATGCCCTTTGGATAC-3′。
其中：Alt-F1、R1扩增片段约370 bp；Alt-F2、R2扩增片段约240 bp。
分别从不同红枣真菌菌丝中提取基因组DNA，作为PCR反应的模板，分别用以上2种引物进行PCR，看能否扩增出相应的条带。PCR反应体系为50 μL：DNA模板2 μL、10×缓冲液5 μL、dNTP（每种2.5 mmol/L）2 μL、引物（10 μmol/L）各2 μL、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.4 μL，无菌水补足至50 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35个循环，72 ℃延伸10 min。反应结束后取5 μL PCR产物加1 μL 6×溴酚蓝上样缓冲液，在2%琼脂糖凝胶上110 V电泳35 min。
1.2.3 2种引物的比例对多重PCR反应的影响
引物Alt-F2＼R2和Alt-F1＼R1的比例分别为4 ∶1、3 ∶1、2 ∶1、1 ∶1、1 ∶2，PCR反应体系为50 μL：DNA模板2 μL、10×缓冲液5 μL、dNTP（每种2.5 mmol/L）2 μL、引物各2 μL、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.4 μL、无菌水补足至50 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸40 s，38个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后取5 μL PCR产物加1 μL 6×溴酚蓝上样缓冲液，在2%琼脂糖凝胶上110 V电泳35 min。
1.2.4 退火温度对多重PCR反应的影响 选择1种引物的比例，分别在不同的退火温度下进行PCR，其他条件不变。
1.2.5 Mg2+浓度对多重PCR反应的影响
在PCR反应体系中，改变Mg2+的加入量，使其终浓度分别为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol/L，其他条件不变，进行PCR。
1.2.6 dNTP浓度对多重PCR反应的影响
在PCR反应体系中，改变dNTP的加入量，使其终浓度分别为0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 mmol/L，其他条件不变，进行PCR。
2 结果与讨论
2.1 链格孢菌引物单重PCR特异性验证
链格孢菌引物单重PCR特异性验证结果见图1、图2。
从图1、图2可以看出，Alt-F1＼R1和Alt-F2＼R2引物能够从链格孢属中的2种菌株：XZJ1（Alternaria sp.）和XZJ2（Alternaria brassicae）的DNA中分别扩展出大小约400、250bp的特异条带，而从其他真菌如扩展青霉、皮落青霉、根霉、毛霉、黑曲霉、链孢霉、长梗木霉的DNA中未能扩增出条带，说明这2对引物可以作为链格孢霉的特异性引物。
2.2 多重PCR反应中2种引物的比例优化
多重PCR反应中2种引物的比例优化结果见图3。从图3可以看出，当引物Alt-F2＼R2和引物Alt-F1＼R1的比例为3 ∶1时，2条带扩增效果较好。随着引物比例增大，小条带逐渐减弱，因此2种引物的比例初步确定为Alt-F2＼R2 ∶Alt-F1＼R1=3 ∶1。
2.3 多重PCR反应退火温度优化
多重PCR反应退火温度优化结果见图4。从图4可以看出，当退火温度为52 ℃时，2条带扩增效果较好，因此退火温度初步确定为52 ℃。
2.4 多重PCR反应Mg2+浓度优化
多重PCR反应Mg2+浓度优化结果见图5。从图5可以看出，Mg2+浓度变化对引物Alt-F2＼R2和引物Alt-F1＼R1的多重PCR反应影响不大，因此Mg2+浓度采用1.5 mmol/L。
2.6 多重PCR反应dNTP浓度优化
多重PCR反应dNTP浓度优化结果见图6。从图6可以看出，当dNTP浓度超过0.05 mmol/L后，其浓度变化对引物Alt-F2＼R2和引物Alt-F1＼R1的多重PCR反应影响不大。
3 结论
多重PCR检测需要通过调整PCR反应体系中某些反应条件来实现。试验中发现引物比例、退火温度是影响多重PCR的2个重要因素，而dNTP、Mg2+浓度对多重PCR的影响较小。研究验证了2对链格孢菌引物具有扩增特异性，并初步确定了2对引物多重PCR的引物比例、退火温度、Mg2+浓度和dNTP浓度。表明该方法可检测枣中链格孢菌，具有快速、灵敏并且特异性的优点。
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