摘要：以乙醇诱发小鼠酒精性肝损伤为模型，研究野西瓜提物对小鼠酒精性肝损伤保护作用。结果表明，按照2.0～ 3.5 mg/kg的野西瓜提取物连续灌胃给药28 d未对小鼠体重产生显著性影响，显著性降低小鼠肝组织丙二醛和甘油三脂含量、提高谷胱甘肽含量（p<0.01）。肝组织病理分析显示上述计量明显降低对小鼠肝脏组织损伤。因此，野西瓜提取物（2.0～3.5 mg/kg）对由乙醇诱发小鼠酒精性肝损伤具有保护作用，其功能性组分可能是葫芦素A。
关键词：野西瓜；酒精性肝损伤；乙醇诱发；病理分析
中图分类号：R285 文献标志码：A doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2018.09.014
Protective Properties of Wild Watermelon（Citrullus colocynthis L.）Extract
on Chemical-induced Liver Injury in Mice
SONG Shuhui1，SHI Yue1，2，3，WANG Yubin1，LI Wu1，4，MA Yue1，3，ZHAO Xiaoyan1，4，*ZHANG Chao1，2，3
（1. Beijing Vegetable Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097，China；
2. Beijing Key Laboratory of Fruits and Vegetable Storage and Processing，Beijing 100097，China；3. Key Laboratory of Vegetable Postharvest Processing，Ministry of Agriculture，Beijing 100097，China；4. Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops（North China），Ministry of Agriculture，Beijing 100097，China）
Abstract：For the first time，protective property of the wild watermelon extract was evaluated with the alcohol induced liver injury in mice as the model. The intake of the wild watermelon extract of 2.0～3.5 mg/kg for 28 d gave no significant influence on the body weight on the mice. The intake of the extract reduced the liver malondialdehyde and triglyceride content，and raised the glutathione content significantly. Moreover，liver tissue pathology of the mice was reduced after the intake of the extract. Therefore，the extract of wild watermelon（2.0～3.5 mg/kg）has a protective effect on acute liver injury induced by alcohol in mice，and its functional component could be cucurbitacin A.
Key words：Citrullus colocynthis L.；chemical-induced liver injury；alcohol-induced；pathological analysis
野西瓜（Citrullus colocynthis L.），為葫芦科西瓜属植物，原产于北非、中亚和西亚，在我国西北有少量分布[1]。野西瓜是维吾尔医传统药材，是伊斯兰各国临床药材。维吾尔医理论认为野西瓜具有祛风、消肿、祛痰质、生津液等功效[2]，主要用于治疗肝病、血液病和糖尿病[3-4]。现代科学动物试验研究证明野西瓜藤提取物对糖尿病小鼠具有降血糖作用[5]；野西瓜果实提取物具有降低糖尿病小鼠、大鼠和兔子血糖水平的作用[6-8]，但是采用现代科学试验研究野西瓜果实对肝损伤保护作用的研究鲜有报道。
试验以乙醇诱导的酒精性肝损伤小鼠为研究对象，通过灌胃给予野西瓜提取物28 d，考查小鼠肝脏组织中关键代谢指标和病理组织形态，评价野西瓜提取物对小鼠由酒精性肝损伤的保护作用，并通过化学检测方法对功能性组分进行探索，以期为野西瓜资源的开发奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与化学试剂
野西瓜，采自北京蔬菜研究中心四季青农场；SPF级雄性昆明种小鼠，体重18.3～22.4 g，由军事医学科学院实验动物中心提供，许可证编号SCXK（军）2012-004；葫芦素A（纯度98%）、葫芦素B（纯度99%）和葫芦素E（纯度95%），由上海同田生物技术股份有限公司提供；乙腈为色谱纯，由迪马科技有限公司提供；化学试剂均为分析纯，中国化学试剂有限公司提供；还原性谷胱甘肽检测试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供。
1.2 试验设备
HPLC 1260，美国安捷伦科技有限公司产品；R215型旋转蒸发器，BUCHI Labortechnik公司产品；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司产品；Leica RM2135型切片机；万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司产品；Sigma 3-18K型离心机，Sartorius仪器有限公司产品；RT 5型磁力搅拌器，德国IKA-WERKE GMBH & Co KG产品；食品料理机，飞利浦科技有限公司产品；Eppendorf Research plus 40，200，1 000，5 000 μL单道移液器；Unico7200分光光度计；恒温水浴锅，北京市医疗设备厂产品；CHA-S型恒温气浴箱、混匀器SK-1、FS-2型可调高速匀浆机，常州国华电器有限公司产品；低温可调离心机，北京离心机厂产品。
1.3 野西瓜提取物的制备
将成熟野西瓜采收，置于10 ℃的冷库中预冷24 h，使用自来水清洗果实表面，使用食品料理机将果实机械破碎2 min，采用双层纱布过滤去除瓜籽等杂质获得野西瓜汁，加入野西瓜汁4倍体积的丙酮溶液，机械搅拌90 min，采用分液漏斗收集丙酮提取物，旋转蒸发至原体积的10%，冷冻干燥获得野西瓜提取物。
1.4 葫芦素A含量的测定方法
建立HPLC的方法测定葫芦素A含量的方法。准确称量葫芦素A标准品5～10 mg置于10 mL容量瓶中，用色谱级乙醇定容至10 mL，配制成标准品母液，再将此标准品母液分别稀释成5个不同质量浓度，采用Agilent HPLC 1260系列色谱仪进行分离，色谱柱选择Agilent XBridge-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），采用DAD检测器，监测波长228 nm光谱信息，控制柱温25 ℃，进样量20 μL，色谱柱流速 1 mL/min，流动相A为纯水，流动相B为乙腈，采用流动相A和流动相B各50%，洗脱25 min。以葫芦素标准品的质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
葫芦素A标准品液相色谱图及其标准曲线见图1。
图1显示葫芦素A标准品在波长228 nm处的色谱图，葫芦素A的保留时间为2.316 min，其回归方程为Y=51 856X+230.8，相关系数R2=0.996 5。
采用外标法测定样品中葫芦素A含量，将野西瓜提取液使用0.22 μm微孔滤膜过滤，使用与标准品相同的液相条件进行分析，计算样品中葫芦素A的含量。
1.5 试验设计及处理
将小鼠进行适应性饲养3 d后，随机分为对照组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，共5组，每组12只小鼠。低剂量组、中剂量组和高剂量组每天给药剂量为0.7，2.0，3.5 mg/kg体重的野西瓜提取物，野西瓜提取物使用纯水溶解，灌胃剂量为5 μL/g体重。对照组和模型组给予同等体积蒸馏水灌胃，连续4周。在试验第29天将模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组按12 mL/kg经口腔灌胃体积分数为50%的乙醇，对照组以等量蒸馏水灌胃。隔夜禁食16 h后处死，取肝脏，测定肝脏组织中还原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）和甘油三酯（TG）含量，并取肝脏做病理切片，采用HE染色，观察肝脏的病理损伤情况[9]。
1.6 GSH、MDA和TG的测定方法
将肝脏用生理盐水制成10%的肝匀浆，检测肝组织中GSH、MDA和TG的含量。肝组织中MDA采用硫代巴比妥酸法测定、GSH采用南京建成生物工程研究所的试剂盒方法测定；TG含量采用505nm比色法测定。
1.7 肝脏病理组织学观察及评分标准
（1）肝脏病理切片的制备。将小鼠肝脏用冷生理盐水洗去浮血，拭干。于肝左叶取材4块，每块大小约为1.5 cm×1.5 cm×0.4 cm，立即用10%中性甲醛固定；经70%，90%，95%，100%乙醇脱水；无水乙醇与二甲苯混合液（V∶V=1∶1）中30 min，再移入二甲苯中15～20 min；移入二甲苯与石蜡混合液（V∶V=1∶1），在60 ℃恒温箱中放置30 min，再移入融化的石蜡中浸蜡；将浸蜡的组织块置于包埋框内的石蜡中包埋；用切片机制成厚度在4 μm的切片；HE染色法染色；用显微镜观察并拍照[9-10]。
（2）分级方法。肝组织病变程度参照1981年国际病理学组确定的ALD组织学诊断标准：①肝细胞脂肪变：0分（<5%），1分（5%～33%），2分（34%～66%），2分（34%～66%），3分（>66%）；②小叶内炎症（20倍镜计数坏死灶）：0分（无），1分（<2个），2分（2～4个），3分（>4个）；③肝细胞气球样变：0分（无），1分（少见），2分（多见）；④肝纤维化分期（0～4）：0，无纤维化；1，肝腺泡3区轻度窦周纤维化；2，肝腺泡3区窦周纤维化合并门脉周围纤维化；3，桥接纤维化；4，高度可疑或确诊肝硬化，包括NASH合并肝硬化、脂肪性肝硬化和隐源性肝硬化[11-10]。
1.8 结果判定
在小鼠急性肝损伤模型成立的前提下，GSH、MDA和TG指标中任何二项和肝组织病理结果为阳性，可判定受试样品对酒精性肝损伤有辅助保护功能[12-14]。
1.9 数据分析
采用SPSS V11.0 统计软件进行统计分析，数据用平均值±标准偏差表示，使用t检验比较组间差异的显著性（p<0.05或0.01）。
2 结果与讨论
2.1 野西瓜提取物对小鼠体重的影响
野西瓜提取物对小鼠体重的影响见表1。
各处理组1 d的体重没有显著性差别，在14，28 d的体重与对照组比较，差异无统计学意义（p>0.05）。因此，在28 d的给药过程中，野西瓜提取物对小鼠体重无显著性影响。
2.2 野西瓜提取物对肝组织中MDA，GSH和TG含量的影响
肝损伤是多因素参与的复杂过程，乙醇是试验性肝损伤模型的常用药物，对肝脏具有较强的损伤作用，可导致肝细胞的变性、坏死、脂肪变性、纤维化和癌变。研究显示，在乙醇进入体内经肝激酶P450激活产生过氧自由基和氧自由基，这些自由基会使生物膜脂质发生过氧化反应，与膜上脂质及蛋白质分子进行不可逆结合，造成脂肪酸异常代谢，进而引起肝组織中MDA和GSH降低，引起肝弥漫性坏死和炎症症状[11，14-16]。表2显示野西瓜提取物对小鼠肝脏组织中MDA和GSH含量的影响。MDA作为脂质过氧化的最终产物，其含量增多表明脂质过氧化反应增强，而GSH是一种抗氧化剂，能有效地还原氢过氧化物自由基生成相应醇，达到阻断或减轻过氧自由基和氧自由基所致的脂质过氧化链锁反应的目的[11，13]。试验结果显示，模型组的MDA显著高于对照组，GSH显著低于对照组，差异均有统计学意义（p<0.01），因而乙醇引起的小鼠急性肝损伤建模成功。在建模成功的前提下，中剂量组和高剂量组的GSH均显著高于模型组，MDA显著低于模型组（p<0.05）。因此，中剂量和高剂量的野西瓜提取物具有降低MDA含量、升高GSH含量的作用。
TG表征肝脏组织中甘油三酯积聚情况，在脂肪酸代谢被阻断或减缓时，会出现含量升高的情况。试验结果显示，在小鼠急性肝损伤建模成功的前提下，低剂量、中剂量和高剂量组的TG含量均显著低于模型组的含量（p<0.01）。因此，低剂量、中剂量和高剂量组的给药均促进小鼠的脂肪代谢。
野西瓜提取物对小鼠肝脏组织中MDA，GSH，TG含量的影响见表2。
2.3 野西瓜提取物对小鼠肝组织病理的影响
野西瓜提取物对小鼠肝组织病理的影响见图2。
结果显示，对照组细胞以中央静脉为中心，向四周呈放射状排列，细胞壁均匀，肝小叶结构完整，中央静脉和肝血窦无充血水肿，未见干细胞变性和坏死；而模型组细胞排列松弛，出现肝细胞气球样变形态，有多处坏死灶，其中以肝小叶中央区域最为严重，出现部分脂肪变性；与模型组相比，随着给药剂量增加，肝细胞脂肪变性和水样变性明显减少，坏死病灶明显减少，其中以高剂量作用最为显著，高剂量组的肝细胞组织均匀，细胞核清晰，较接近于对照组。
进一步对小鼠肝脏组织切片进行分析，按照肝细胞脂肪变性、小叶内炎症、肝细胞气球样变和肝纤维化4个方面对其进行分析总结，计算处理组的平均积分。模型组肝脏组织积分显著高于对照组，差异有统计学意义（p<0.01），证明小鼠急性肝损伤模型成立。中剂量和高剂量组肝脏组织积分明显低于模型组。
野西瓜提取物对小鼠肝组织病理的影响见表3。
2.4 野西瓜提取物功能性组分检测
采用HPLC的方法检测野西瓜提取物中葫芦素组分，将样品的HPLC图谱分别与葫芦素A、葫芦素B和葫芦素E的标准品HPLC图谱比对，结果发现野西瓜提取物含有葫芦素A，未检出葫芦素B和葫芦素E，葫芦素A的含量为25.6 nM/kg果实，野西瓜提取物中葫芦素A的纯度为10%。
野西瓜提取物液相色谱见图3。
现代药理研究表明葫芦素具有抗肿瘤、抗菌消炎、抗人类免疫缺陷病毒、保肝、提高机体免疫力等药理活性[17]。前期研究显示甜瓜蒂中葫芦素B和葫芦素E对CCl4或酒精引起的肝损伤均显示保护作用，研究使用的剂量介于0.2～6.0 mg/kg，并推测葫芦素B是通过恢复载脂蛋白功能将甘油三酯以β -脂蛋白形式排出体外，从而对肝损伤起到保护作用[11，15，16，18]。从分子结构上方面分析，葫芦素A，B和E均属于四环三萜类同系物，其区别在于葫芦素A比葫芦素B在C9位上的甲基上多1个羟基，比葫芦素E在C1和C2之间少1个双键（图4）。推测葫芦素A在功能上与葫芦素B和葫芦素E具有相似之处。因此，葫芦素A可能是野西瓜提取物对肝损伤的保护作用功效成分之一。
葫芦素A，B和E的分子结构见图4。
3 结论
以野西瓜提取物对小鼠灌胃28 d，采用诱导的小鼠急性肝损伤模型，结果发现按照2.0，3.5 mg/kg的野西瓜提取物给药28 d，即中剂量组和高剂量组，对小鼠的体重没有显著性影响，显著降低小鼠肝组织MDA和TG含量、升高GSH含量，差异有统计学意义（p<0.01），同时，肝组织病理分析显示中剂量组和高剂量组肝脏组织积分明显低于模型组。野西瓜提取物（2.0～3.5 mg/kg）对由乙醇诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用。进一步的分析结果显示，葫芦素A可能是野西瓜提取物中的主要功能性成分。
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