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摘要目的：研究益奥源胶囊试验对小鼠降血糖的作用及胰腺病理组织学变化情况。方法：选取造模成功的2型糖尿病小鼠60只，随机分为模型对照组，阳性对照组，益奥源胶囊小、中、大剂量组以及喂普通饲料的正常对照组，每组10只。阳性对照组灌胃盐酸二甲双胍400 mg/kg，益奥源胶囊小、中、大剂量组分别灌胃益奥源胶囊混悬液3.0、6.0、12.0 g/kg，模型对照组灌胃和正常对照组灌胃等体积的蒸馏水，给药1次/d，连续给药40 d。在给药过程中每周定时对小鼠的体质量和血糖含量进行测量，末次测血糖后每组挑选2只接近血糖平均值的小鼠取胰腺作组织病理学观察。结果：与模型对照组比较，益奥源胶囊小剂量组的体质量在给药第1周和第3周后比较有所降低，第1周、第3周和第4周的血糖水平降低；胰岛病理组织学实验结果表明，益奥源胶囊能改善糖尿病模型小鼠胰岛细胞的功能，促进胰岛细胞的修复。结论：益奥源胶囊具有明显降血糖作用，并促进胰岛细胞的修复。
关键词益奥源胶囊；2型糖尿病小鼠；体质量；血糖水平；胰岛细胞
AbstractObjective：To study the hypoglycemic effect and pancreatic pathological changes of Yi′aoyuan capsule on mice. Methods：The model of type II diabetes mouse were randomly divided into the model control group， the positive control group， the low， medium and high dose of Yi′aoyuan capsule group and the normal group with common feed， with 10 mice in each group. The positive control group was given 400 mg/kg metformin hydrochloride by gavage. Mice of Yiaoyuan capsule group were administrated by intragastrical gavage with 3 dosage of Yi′aoyuan capsule （3.0， 6.0， 12.0 g/kg）. The model control group and the normal group received the same volume of distilled water intragastrically. The drugs were administrated once a day for 40 days. The weight and blood-sugar level of mice were calculated weekly. Islet tissue pathology and electron microscopy islet cell were observed after the last administration using two mice obtained from each group， of which blood-sugar level were close to the average. Results：Compared with the model control group， the weight of the first week and third week of the low dose group of Yi′aoyuan capsule increased （34.15±4.21 g vs 38.81±4.56 g， 34.70±3.78 g vs 39.81±5.63 g）； blood-sugar level of the first， third and fourth week decreased （16.47±5.43 mol/L vs 24.59±2.70 mol/L， 15.60±5.73 mol/L vs 22.42±4.96 mol/L， 14.37±5.25 mol/L vs 23.38±5.18 mol/L）； The damaged islet cells of mice could be improved and the islet β cells could be repaired by Yi/aoyuan capsule. Conlusion：Yi/aoyuan capsule has a significant hypoglycemic activity and it also has a function to repair islet β cells.
Key WordsYi′aoyuan capsule； Type II diabetes mouse； Weight； Blood-sugar level； Islet cell
中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.01.040
益奥源胶囊是按照中医理论为指导，以主治多渴“参苓散”为基础加减化裁而成的中药方剂，以人参、茯苓、甘草、白术、黄芩等药味组成，具有滋阴固涩、理气健脾、益肝补肾、润燥生津之功效。本实验采用链脲酶素结合饲喂高糖高脂饲料致2型糖尿病小鼠模型，观察益奥源胶囊对糖尿病模型小鼠的降血糖作用。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1动物SPF级昆明种小鼠60只，体质量16～18 g，雄性，購自军事医学科学院实验动物中心，许可证编号SCXK（军）2012-0004。实验动物饲养环境：室温20～26 ℃，相对湿度20%～26%，光照良好，自由摄食和饮水。
1.1.2药物益奥源胶囊由湖南金润药业开发有限公司提供，为黄色粉末；盐酸二甲双胍片（阳性对照药，中美上海施贵宝制药有限公司生产，批号AAG45G4）。
1.1.3试剂与仪器链脲霉素（STZ，Sigma公司生产，批号C8H15N307）；柠檬酸一水结晶（上海翊圣生物科技有限公司生产，批号C06829）；柠檬酸三钠二水结晶（上海翊圣生物科技有限公司生产，批号C14879）；高糖高脂疾病模型动物饲料块（北京华阜康生物科技股份有限公司生产）。AR3130奥豪斯电子天平（梅特勒托利斯多仪器（上海）有限公司）；EPS-2001电子天平（长沙湘平科技开发有限公司）；1001实验室高剪切分散乳化机（江苏南通克本尔混合设备有限公司）；GU00685575罗氏活力型血糖仪（德国罗氏诊断有限公司）；罗康全活力型血糖试纸（德国罗氏诊断有限公司，批号23471631）；光镜和电镜仪器（军事医学科学院）。
1.2方法
1.2.1分组与模型制备2型糖尿病小鼠模型的建立：取SPF级正常昆明雄性小鼠110只，体质量14～16 g，普通饲料适应性喂养1周后，随机留下10只继续以普通饲料喂养作为正常对照组外，其余喂养高糖高脂饲料6 d后，空腹灌胃以0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH 4.5）配制的链脲霉素30 mg/kg，隔日1次，连续6次，正常对照组同步灌胃柠檬酸缓冲液，末次灌胃后3 d，剪尾采血检测空腹血糖水平。以空腹血糖≥10.0 mmol/L为2型糖尿病模型成功的标志，将血糖未达标或过高的动物剔除，最后将造模成功的小鼠按血糖值的水平随机分为模型对照组，阳性对照组和益奥源胶囊小、中、大剂量组。
1.2.2给药方法正常对照组，模型动物对照组灌胃等体积的蒸馏水，0.4 mL/20 g，1次/d，阳性药对照组灌胃盐酸二甲双胍，400 mg/kg，益奥源胶囊小、中、大剂量组分别灌胃以益奥源胶囊粉末的混悬液3个剂量（3.0、6.0、12.0 g/kg）。
1.2.3检测指标与方法不同时间定点称体质量，不同时间定点剪尾测空腹血糖；末次测血糖后，挑选每组接近血糖平均值的小鼠2只，取胰腺作胰岛组织病理学观察和电镜胰岛细胞学观察。胰岛病理组织切片，以电子照片的形式记录并加以注释说明。
1.3统计学方法采用SPSS 23.0统计软件对数据进行统计学分析，数据以均值±标准差（±s）表示，组间差异比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1益奥源胶囊对小鼠体质量的影响结果显示，益奥源胶囊小剂量组在给药后第1周和第3周，与模型对照组比较，小剂量组差异有统计学意义（P<0.05）；第2周、第4周、第5周，与模型对照组比较，小剂量组差异无统计学意义（P>0.05），但有增加体质量的趋势。益奥源胶囊中剂量组小鼠在给药后直至实验结束体质量与模型对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），但有增加体质量的趋势。益奥源胶囊大剂量组小鼠在给药后第1周、第2周、第3周内体质量与模型对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），第4周、第5周、第6周体质量与模型对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），但有增加体质量的趋势。见表1。
2.2益奥源胶囊对小鼠血糖水平的影响结果显示，益奥源胶囊小剂量组在第1周内血糖水平与模型对照组比较，差异具有极显著的统计学意义（P<0.01），在给药第3周内血糖水平与模型对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），在给药第4周内血糖水平与模型对照组比较，差异具有显著的统计学意义（P<0.01）。在给药第2周、第5周、第6周血糖水平与模型对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），但血糖水平也有下降趋势。在给药6周内，益奥源胶囊中、大剂量观察组小鼠血糖水平与模型组比较，差异均无统计学意义（P>0.05），但中剂量和大剂量组血糖水平均有下降趋势。见表2。
2.3组织病理学结果（光学显微镜）末次测血糖后，挑选每组接近血糖平均值的小鼠2只，取胰腺作胰岛组织病理学观察，胰岛病理组织切片，以电子照片的形式记录并加以注释说明。6组实验中，共计12只动物，每组2个照片。放大倍数见标尺。其中，1-1与1-2为正常对照组，结果显示胰岛散在分布，呈圓形或椭圆形，与外分泌腺交界规整清楚，胰岛细胞密度适中，细胞核清晰，细胞质淡染，属于正常胰岛细胞；1-3与1-4为模型组，结果显示胰岛数量显著减少，体积小，胰岛细胞密度不匀，部分细胞肿胀，细胞质空泡，部分细胞核固缩，说明胰岛细胞受到中度损伤；1-5与1-6为模型对照组，结果显示胰岛数量减少，形状不规则，胰岛细胞密度增加，少数细胞肿胀，细胞质空泡，细胞核固缩，说明胰岛细胞通过增生来修复损伤；1-7与1-8为益奥源胶囊小剂量组，其中1-7显示胰岛数量增多，体积增大，但其形状都不规则，胰岛细胞密度呈略微或显著增加，部分细胞肿大和核固缩，说明胰岛细胞通过增生来修复损伤；1-9与1-10为益奥源胶囊中剂量组，1-9结果显示胰岛形状不规则，大小不匀，胰岛细胞密度显著增加，而1-10结果显示胰岛数量减少，胰岛旁有淋巴细胞聚集灶，胰岛细胞密度适中，细胞核固缩，这些都说明胰岛细胞出现了损伤修复，且局部出现炎性反应；1-11与1-12为益奥源胶囊大剂量组，结果显示胰岛数量减少，胰岛细胞密度适中，少数细胞轻度肿胀，细胞质空泡，细胞核固缩，说明胰岛细胞进行了损伤修复。见图1。
2.4细胞病理学结果（透射电子学显微镜）末次测血糖后，挑选每组接近血糖平均值的小鼠2只，取胰腺作电镜胰岛细胞学观察，胰岛病理组织切片，以电子照片的形式记录并加以注释说明。共计12只动物，每只2个图片。其中，2-1、2-2、2-3为正常对照组，结果显示胰岛β细胞形态规整，细胞内分泌颗粒丰富，细胞器和细胞核结构正常；2-4、2-5、2-6为模型对照组，结果显示胰岛β细胞内分泌颗粒不同程度减少，出现无颗粒空泡，但细胞器结构正常，说明胰岛β细胞受到损伤；2-7、2-8、2-9为阳性对照组，结果显示胰岛β细胞内分泌颗粒减少，个别线粒体结构损伤，细胞核结构正常，说明胰岛β细胞受损，但较模型对照组减轻；2-10、2-11、2-12为益奥源胶囊小剂量组，结果显示，2-10的胰岛β细胞内分泌颗粒明显减少，核染色质聚集，2-11的胰岛β细胞内分泌颗粒多，结构基本正常，与正常对照组比较差别不大，2-12的胰岛β细胞内分泌颗粒较多，细胞器结构正常，但核形状不规整，说明这些胰岛β细胞受损，但较模型对照组减轻；2-13、2-14、2-15为益奥源胶囊中剂量组，结果显示2-13的胰岛β细胞内分泌颗粒明显减少，2-14和2-15的胰岛β细胞内分泌颗粒较多，细胞器结构基本正常，说明这些胰岛β细胞受损，但较模型对照组减轻；2-16、2-17、2-18为益奥源胶囊大剂量组，结果显示2-16和2-17的胰岛β细胞内分泌颗粒减少，细胞器结构基本正常，2-18的胰岛β细胞内分泌颗粒较多，细胞器结构基本正常，说明这些胰岛β细胞受损，但较模型对照组减轻。放大倍数见标尺。见图2。
3讨论
糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是遗传、环境等因素长期作用所导致的一种慢性、全身性代谢疾病[1-2]，有Ⅰ型和Ⅱ型的区别[3]，是一种全球性的多因素的代谢性疾病，随着生活水平的提高，DM已成为严重威胁中国人健康的慢性疾病[4]世界卫生组织预计2型DM将会成为全球第5大致死性疾病，其具有病程长、预后差、病情反复发作、致死率和致残率较高等特点[5]并且近年来糖尿病发病有年轻化趋势[6-7]。指导患者合理运动，鼓励患者根据自身情况，适当运动，减轻体质量，从而可降低胰岛素的抵抗[8]，糖尿病是内分泌代谢紊乱性疾病，可通过多种发病途径引起血糖的升高。建立理想的糖尿病动物模型，对深入研究糖尿病的病因、发病机制、临床治疗以及预防等至关重要。
当前，治疗糖尿病以药物为主，药物一般能较好控制血糖，但长期服用会造成不良反应[9]。通过饮食的早期干预[10]，是预防和控制糖尿病发生最安全有效的选择[11]，中药防治糖尿病有着西药不可替代的优势，具有作用温和持久、不良反应小、可长期使用等特点。很多用于治疗糖尿病的中药方剂中都含有黄连或其主要成分为黄连生物碱[12]的物质。汤喜兰等[13]研究了黄连总生物碱对糖尿病大鼠的降血糖作用，发现黄连总生物碱灌胃组能明显降低其空腹血糖和糖化血清蛋白水平，同时也可显著降低谷胱甘肽—过氧化物酶活性，从而最终可降低糖尿病大鼠的血糖。已有文献报道，桑叶中生物碱组分可降低糖尿病小鼠的血糖、促进肝糖合成、增加肝糖原及增强糖尿病动物糖的贮藏能力[14]。另有研究[15]发现，桑叶总生物碱可以有效缓解由高血糖引发的并发症如脾脏肿大、胸腺萎缩等，明显降低试验小鼠血糖值水平，从而起到降血糖作用。
目前使用的动物模型有遗传、诱导获得2种类型[16]。本实验通过采用STZ诱导的方式破环其胰岛β细胞和机体胰岛素分泌不足使血糖值持续稳定升高而建立2型糖尿病小鼠[17-18]。STZ能选择性地破坏胰岛β细胞，使机体胰岛素分泌减少[19-20]。本实验通过测定糖尿病小鼠空腹血糖值，并最终对各组筛选的2只小鼠进行病理学组织切片观察，实验结果显示益奥源胶囊具有明显的降血糖作用，对胰岛β细胞也具有显著的修复作用。但上述结果只是初步的实验结果，需要开展进一步的、全面的、深入的实验研究予以证实。
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（2016-09-14收稿责任编辑：张文婷）