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【摘要】 目的：构建EV71基因的原核表达载体，并在原核细胞中进行表达与纯化。方法：根据已知EV71全长核酸序列设计引物，用PCR方法扩增VP1、VP2、VP3和VP4四个基因片段，对目的基因进行酶切并克隆至pET-14b原核表达载体中，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，IPTG诱导表达;所获得的不可溶性蛋白经尿素裂解超声，亲和层析纯化，用SDS-PAGE检测表达产物。结果：测序证实原核重组质粒构建成功;可表达高纯度的四个蛋白，且蛋白大小与预计值相符。结论：成功构建了手足口病主要致病原肠道病毒71型（EV71）的四个衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的原核表达载体，并纯化得到高纯度的四个蛋白，为进一步研究手足口病致病机制奠定了基础。
【关键词】 EV71; 基因克隆; 蛋白表达
Gene Clone and Expression of Capsid Proteins of EV71-the Main Pathogen of HFMD/LIANG Jie，LIU Aihua.//Medical Innovation of China，2019，16（06）：00-008
【Abstract】 Objective：To construct a prokaryotic expression vector of EV71 gene and have gene expression and purification in prokaryotic cells.Method：According to the full-length gene sequence of EV71 reported in GenBank，the primers were designed by using DNA Star software，based on which VP1-VP4 genes were amplified by PCR and inserted into prokaryotic expression vector pET-14b respectively.The constructed recombinant plasmid pET-14b-VPs were transformed to E.coli of BL21 strain for recombinant protein expression under induction of IPTG.The insoluble proteins were lysed in urea by supersonic，and the supernatant was collected for the purification with Ni2+-affinity chromatography，followed by SDS-PAGE.Result：Restrict enzyme digestion analysis and DNA sequencing proved that recombinant plasmids pET-14b-VP1-4 were constructed correctly.We found that the VP recombinant proteins were induced，but mainly existed in the inclusion body.By means of denaturation and renaturation，we obtained VP1-VP4 protein with high purity.Conclusion：Prokaryotic expression plasmids for VP1-VP4 were successfully constructed and the recombinant proteins were induced in E.coli，VP1-VP4 protein were obtained with high purity，which provides a solid foundation to study the mechanism of pathogenesis of HFMD.
【Key words】 EV71; Gene clone; Protein expression
First-author’s address：Guangdong Second Provincial Central Hospital，Guangzhou 510317，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.06.002
自1969年首次从美国加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便中分离到肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）以来，全世界已有十多次爆发和流行[1-3]，特别是20世纪90年代以来，在亚太地区流行日益猖獗。引发手足口病的肠道病毒有20多种（型）。柯萨奇病毒A组的16、4、5、9、10型，B组的2、5型，以及肠道病毒71型均为手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）较常见的病原体[4-5]，柯萨奇A组16型（Coxsakie A16，CoxA16）和EV71最為常见，其中EV71病毒是导致神经系统并发症和死亡病例的主要病原体[6]。
EV71属于小RNA病毒科（Picornaradae）肠道病毒属（Enterovirus）的成员[7]。EV71的病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突起，直径在24～30 nm，核酸为单股正链RNA。病毒粒子的衣壳组成非常复杂，首先由VP1、VP2、VP3和VP4四种外壳蛋白构成原聚体（Protomer），再由5个原聚体拼装成具有五聚体样结构的亚单位。四种衣壳蛋白中，除VP4包埋在病毒粒子外壳的内侧与病毒核心紧密连接以外，其他三种结构蛋白均暴露在病毒颗粒的表面，因而抗原决定簇基本上位于VP1～VP3上[8]（图1）。
EV71病毒可引起神经系统以及呼吸系统损伤，其中肺水肿是该病最严重的并发症以及主要死因，致死致残率较高，已严重威胁儿童的身体健康和生命安全。但目前对EV71具体致病机制仍不清楚，尤其是具体每个衣壳蛋白的功能以及作用于细胞的信号通路，再者临床上尚未发现安全有效的疫苗来预防EV71的感染。鉴于此，本文对肠道病毒EV71的衣壳蛋白基因进行体外克隆并在大肠杆菌中表达。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 质粒与菌种 pET-14b、大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）均由本室保存，EV71病毒全长模板由北京军事医学科学院疾病预防控制所宋宏彬教授馈赠。
1.2 主要试剂 引物由华大基因有限公司合成。限制性内切酶（Kpn I、Not I）购自TaKaRa公司;高保真DNA聚合酶KOD plus neo、Ligation High连接酶是Toyobo公司产品，100 bp和1 kD DNA ladder购自Axygen公司;异丙基-β-D-硫代半乳糖（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）购自Sigma-Aldrich公司;QIAprep Spin Miniprep Kit和Ni2+-NTA亲和树脂购自Qiagen公司;苯甲磺酰胺（phenylmenthylsulfonyl fluoride，PMSF）和蛋白酶抑制剂混合物（cocktail of proteases inhibitor）购自美国Sigma公司;尿素、氨苄青霉素及其他试剂均为进口或国产分析纯。
1.3 pET-14b-VP1/VP2/VP3/VP4重组质粒的构建 利用PCR技术以EV71全长序列为模板，使用特异性引物（表1）分别扩增VP1～VP4编码序列。用高保真DNA聚合酶KOD plus neo进行PCR扩增，反应条件为98 ℃，10 s;58 ℃，30 s;68 ℃，1 min，35个循环。扩增片段预期大小分别为914 bp（VP1）、785 bp（VP2）、749 bp（VP3）、227 bp（VP4）。将PCR产物和载体pET-14b-MCS分别用Kpn I和Not I双酶切并电泳切胶回收后，用Ligation High连接酶连接，将连接反应混合物转化大肠杆菌株DH5。挑取单菌落接种于Amp+的LB培养基中，37 ℃振摇过夜。取5 mL菌液用AxyPrep质粒小量制备试剂盒提取质粒后，使用上述引物进行质粒PCR鉴定。PCR鉴定产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶图像分析仪上成像。重组载体最终经测序鉴定无误后，置-20 ℃保存备用。
1.4 His-VP1/VP2/VP3/VP4融合蛋白的原核表达及纯化 将阳性重组质粒（图2）转化大肠杆菌株BL21（DE3）。挑取单菌落，置于2 mL LB培养基（Amp+）中，37 ℃振摇培养至D600约为0.6 h，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导，继续振摇3 h。利用12% SDS-PAGE来鉴定表达融合蛋白的菌落。
对高效表达带His标签的VP1、VP2、VP3、VP4融合蛋白的细菌，扩增到200 mL体积并进行IPTG诱导。8 000 g，4 ℃离心5 min，收集细菌并重悬于8 mL结合缓冲液（20 mmol/L Tris-HCL，500 mmol/L NaCl，5 mmol/L咪唑，pH值8.0）在冰上超声裂解细菌，14 000 g，4 ℃离心30 min，此时收集部分上清及沉淀行12% SDS-PAGE鉴定可知，His-VP1～VP4蛋白都主要以包涵体的形式存在于沉淀中。因此，将各自的沉淀收集，使用变性复性的方法纯化：继续使用结合缓冲液把沉淀重悬后14 000 g，4 ℃离心30 min，去上清，往沉淀中加入含8 mol/L尿素、5 mmol/L DTT的裂解缓冲液，室温超声使细菌充分裂解，再将超声后液体室温孵育过夜，直至溶液变澄清后，20 ℃，14 000 g，
30 min离心，将上清转移到新的EP管中。20 ℃，14 000 g，15 min再次离心，获取清澈的上清液。将上清转入装有Ni2+-NTA亲合树脂的层析柱中，并让其自然流出，然后用5 mL含8 mmol/L尿素的结合缓冲液洗去未结合蛋白，再用5 mL（1 mL/次）含8 mmol/L尿素的冲洗缓冲液（20 mmol/L Tris-HCL，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，8 mmol/L尿素，pH值8.0）洗涤非特异结合蛋白，最后用含8 mmol/L尿素的0.5 mL洗脱缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，400 mmol/L咪唑，8 mmol/L尿素，pH值8.0）洗脱重组蛋白，梯度透析并过滤除菌后，用12% SDS-PAGE鉴定结果。
2 结果
2.1 pET-14b-VP1～VP4重组质粒的构建与鉴定 利用PCR技术以扩增得到了相应大小的VP1～VP4编码序列（图3）。将挑取的单克隆提取质粒，并行酶切鉴定，得到酶切阳性克隆（图4）。再把酶切阳性质粒送测序，结果（用T7 promoter primer测通）证实插入到pET14b-MCS载体中的目的片段是正确的（图5）。
2.2 His-VP1/VP2/VP3/VP4融合蛋白的原核表达及纯化 将上述构建成功的重组载体转化大肠杆菌株BL21（DE3），诱导表达后发现四个衣壳蛋白均为不可溶的包涵体蛋白，使用尿素變性复性的方法纯化，获得高纯度的His-VP1～VP4四个蛋白，且蛋白表观质量与理论预期相符，但VP1～VP3表达量不高（图6）。
3 讨论
自1997年来，EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势[9]。1998年我国台湾地区EV71感染大爆发[10]。近几年来，我国广东、福建、上海、重庆等地区均有局部流行的报道[11-14]。手足口病流行对我国儿童健康造成严重危害，可导致神经系统和呼吸系统损害，引起高度重视。具体EV71的四个衣壳蛋白分别有什么功能，介导哪条信号通路，引起机体的哪些细胞因子的激活，哪一个蛋白起决定作用，仍没有系统地介绍，所以很有必要对这四个蛋白基因进行分子克隆和蛋白表达纯化，为后续的研究打好基础。
目前已有研究论证，VP1特异性抗体在人SCARB2转基因小鼠中可以减少病毒量和促炎细胞因子的产生[15];徐艳华等[16]发现VP1作为衣壳蛋白能介导EV71的侵入过程;又有研究表明，VP1能激活CaMK-Ⅱ从而使波形蛋白（Vimentin）发生磷酸化和重组，这也是EV71复制所必需的[17];文献[18-21]研究发现VP3参与肠道病毒的形态发生。虽然已有文章试图探讨EV71的四种衣壳蛋白在致病过程中的不同作用，但整体缺乏基础性研究，到目前仍没有一个系统全面的论证。
本项研究，首次成功构建了四个结构蛋白的基因克隆，并且尝试在原核细胞中表达纯化，发现四个衣壳蛋白均为不可溶的包涵体蛋白，利用尿素变性复性的方法纯化，得到了高纯度的His-VP1～VP4四个蛋白，且蛋白表观质量与理论预期相符，但VP1～VP3表达量不高，这可能是由于这三个蛋白分子量相对较大，在宿主菌内表达过程中可溶性较VP4低。总之，系统地将EV71的四个衣壳蛋白进行克隆与表达为后续研究EV71病毒诱导细胞因子的产生以及信号转导通路奠定了坚实的基础。
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