[摘要] 目的 研究丹皮酚（Pae）对EMT6乳腺癌小鼠免疫功能的影响。 方法 将50只小鼠随机分为5组：正常组、模型组、阳性药物组、Pae低剂量组（Pae L）、Pae高剂量组（Pae H），每组各10只。除正常组外，小鼠均接种EMT6乳腺癌细胞（0.2 mL），于接种后24 h给予不同处理，模型组给予生理盐水、阳性药物组给予环磷酰胺25 mg/kg（CTX组）、Pae L、Pae H分别给予Pae 150 mg/kg和300 mg/kg，每日1次，腹腔注射。14 d后，采用流式细胞技术对各组小鼠外周血T淋巴细胞亚群进行检测，酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清中白细胞介素-2（IL-2）与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，RT-PCR对外周血单个核细胞（PBMC）IL-2与TNF-α mRNA表达进行检测。 结果 和正常组相比，模型组CD4+ T细胞亚群数目与CD4+/CD8+比值明显减少（P < 0.05），血清IL-2水平显著降低（P < 0.05）；经治疗，Pae组CD4+ T细胞百分数与CD4+/CD8+比值比模型组明显回升（P < 0.05），同时，血清IL-2和TNF-α水平也高于模型组（P < 0.05），PBMC中IL-2和TNF-α mRNA表达高于模型组（P < 0.05），以Pae H变化更为明显。 结论 Pae通过调节T细胞亚群比例，修复CD4+/CD8+比值改善了EMT6乳腺癌小鼠的免疫功能，并通过促进IL-2和TNF-α基因转录使IL-2和TNF-α分泌增加进而增强Pae的抗肿瘤作用。
[关键词] 丹皮酚；乳腺癌；T细胞亚群；细胞因子
[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）09（c）-0017-03
从20世纪90年代，在中药治疗宫颈癌、肝癌、肺癌、喉癌、乳腺癌等有效方剂中均含有牡丹皮，使人们开始研究牡丹皮的抗肿瘤作用[1-2]。丹皮酚（Paeonol，Pae）是牡丹皮中的活性成分。笔者先前的研究显示，丹皮酚对EMT6小鼠具有抗肿瘤作用，其机制为诱导肿瘤细胞的细胞凋亡[3-4]。而有文献显示丹皮酚能增强正常小鼠的免疫功能，包括非特异、特异性免疫功能[5-6]，Sun等[7]证明了丹皮酚能增加HepA肝癌小鼠腹腔巨噬细胞培养上清液中TNF-α浓度以及脾细胞分泌IL-2的能力。由此推测，丹皮酚抗乳腺癌机制中与免疫功能变化具有一定的关系。因此，本研究通过建立小鼠EMT6乳腺癌模型，采用流式细胞技术、酶联免疫吸附法（ELISA）、RT-PCR方法，对荷瘤小鼠外周血T淋巴细胞亚群，血清中白细胞介素-2（IL-2）与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平以及外周血单个核细胞（PBMC）中的IL-2与TNF-α mRNA表达进行检测，探讨丹皮酚对小鼠乳腺癌免疫功能的影响，为全面地诠释丹皮酚的抗肿瘤作用提供有力的证据。
1 材料与动物
丹皮酚由沈阳药科大学提纯分离，纯度>98%。环磷酰胺（CTX）为江苏恒瑞医药股份有限公司产品，淋巴细胞分离液、红细胞裂解液为Beyotime生物试剂公司产品。抗小鼠CD4+ FITC标记抗体、抗小鼠CD8+ FITC抗体以及小鼠IgG同型对照FITC标记抗体购于北京四正柏生物科技有限公司。IL-2、TNF-α ELISA试剂盒购于北京军事医学科学院免疫学研究所。Trizol试剂购于Gibco公司。总RNA提取试剂盒、反转录cDNA合成试剂盒购于大连Takara生物公司。β-actin多克隆抗体来自北京博奥森生物有限公司。
雌性昆明种小鼠购于北京军事医学科学院实验动物中心。小鼠乳腺癌细胞株EMT6 来自中国医学科学院肿瘤研究所。
2 方法
2.1 建立小鼠乳腺癌模型以及药物处理
按参考文献[3]准备小鼠EMT6乳腺癌细胞株，以生理盐水调节细胞浓度至5×106个/mL。将50只小鼠随机分为5组：正常组、模型组、阳性药物组、Pae低剂量组（Pae L）、Pae高剂量组（Pae H），每组各10只。除正常组外，小鼠均于右前肢腋下接种5×106个/mL的EMT6乳腺癌细胞0.2 mL/只，于接种后24 h给予不同处理，正常组常规饮食水，模型组给予生理盐水，阳性药物组给予CTX 25 mg/kg、Pae L、Pae H分别给予Pae 150 mg/kg和300 mg/kg，每日1次，腹腔注射，共14 d，每日观察，隔日称重。
2.2 小鼠外周血T淋巴细胞亚群的检测
药物处理14 d后，取小鼠外周血，进行全血流式T淋巴细胞亚群的检测。按照试剂盒操作，流式细胞仪计数10 000个细胞观察各亚群的分布并进行统计学分析。
2.3 小鼠血清中IL-2、TNF-α的含量测定
取小鼠外周血，4℃下静置1 h，室温3000 r/min离心5 min，分离血清，各组小鼠血清中IL-2和TNF-α的含量按ELISA试剂盒说明书测定。
2.4 PBMC中IL-2、TNF-α mRNA表达的检测
2.5 统计学方法
采用统计软件SPSS 12.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 丹皮酚对小鼠外周血T细胞亚群影响
和正常组相比，模型组外周血CD4+ T细胞的数目和CD4+/CD8+比率明显降低，差异有统计学意义（P <0.05）；丹皮酚低、高剂量组CD4+ T细胞百分数与CD4+/CD8+比值明显增加，差异有统计学意义（P < 0.05），但低、高剂量之间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；CD8+ T细胞的百分数在各组间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。CTX组CD4+ T细胞数目和CD4+/CD8+比值比正常组均降低，差异有统计学意义（P < 0.05），与模型组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。
3.2 血清中IL-2和TNF-α的变化
与正常组相比，模型组IL-2水平明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05），丹皮酚低、高剂量组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。与模型组比较，丹皮酚低、高剂量组IL-2明显增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。
3.3 PBMC中IL-2和TNF-α mRNA的表达
由图1、表3可见，IL-2、TNF-α凝胶电泳结果出现了502 bp和363 bp的条带，各组条带密度经灰度扫描计算，差异具有高度统计学意义（P < 0.01）。
4 讨论
本研究结果显示，丹皮酚能改善EMT6乳腺癌小鼠外周血T细胞亚群的比例并调节CD4+与CD8+T细胞的比值，促进外周血IL-2和TNF-α以及PBMC的 IL-2和TNF-α mRNA的表达。这说明丹皮酚通过增强EMT6小鼠免疫功能以及促进细胞因子分泌使肿瘤生长受到限制，证明丹皮酚抗肿瘤的重要机制之一是增强了EMT6小鼠的免疫功能。
T细胞是免疫系统最重要的功能性细胞，不仅介导细胞免疫，而且辅助体液免疫[8-9]。T细胞介导的细胞免疫反应在杀伤肿瘤细胞、控制肿瘤生长中起重要作用。T细胞亚群之间的相互作用维持着正常的免疫功能，如果T细胞亚群的数目发生改变，将会导致免疫功能的紊乱[10-11]。T细胞CD4+和CD8+的比值是反映免疫功能紊乱的敏感性指标，也反映了机体内环境的稳定性，两者之间的平衡决定了总的免疫效应[12-13]。当免疫功能受到抑制时，CD4+减少，CD8+上升，CD4+与CD8+比值减低，甚至倒置，提示个体处于免疫功能抑制状态[14]。免疫功能越低下，病期越晚，则预后越差。本研究通过建立小鼠乳腺癌模型模型，显示模型组CD4+减少，CD4+与CD8+比值减低，说明荷瘤小鼠的免疫功能已经处于低下和抑制状态，这非常不利于肿瘤的预后，经过丹皮酚治疗后，CD4+ T细胞的数目增加，CD4+/CD8+的比值得以修复，说明丹皮酚能通过调节T细胞亚群的数目和比例进而改善细胞免疫应答，实验结果同时显示，丹皮酚高剂量在提高CD4+ T细胞数目和修复CD4+/CD8+的比值上，效果比低剂量组更加明显。
IL-2和TNF-α是机体免疫调节网络中起重要调节作用的细胞因子，参与机体免疫反应和炎性反应，并且IL-2与TNF-α具有协同抗肿瘤作用[15-16]。本实验结果显示，丹皮酚低、高剂量组血清中IL-2和TNF-α水平明显升高，同时，IL-2和TNF-α mRNA表达增强，并且以高剂量组变化更为明显。由此推测，丹皮酚通过促使PBMC IL-2和TNF-α mRNA转录功能增强，进而大量分泌IL-2和TNF-α，促进丹皮酚的抗肿瘤效应。
综上得出，丹皮酚是通过调节T细胞亚群比例，修复CD4+/CD8+比值，促进IL-2和TNF-α基因转录使IL-2和TNF-α 分泌增加达到抗肿瘤的作用。
[参考文献]
[1] 孙国平，沈玉先，张玲玲，等.丹皮酚的体内外抗肿瘤作用[J].安徽医科大学学报，2002，37（3）：183-185.
[2] 潘显道，费勤志，朱承根，等.5个丹皮酚酯的合成和体外抗肿瘤活性研究[J].安徽医药，2004，8（1）：16-18.
[3] Wang JJ， Li QW， Ou YT， et al. Antitumor Effects of Paeonol on Mice Bearing EMT6 Breast Infiltrating Ductal Carcinoma [J]. Lat Am J Pharm，2010，9（3）：369-375.
[4] 王建杰，闫冬梅，董航，等.丹皮酚抑制小鼠乳腺癌细胞生长作用及机制的研究[J].中国免疫学杂志，2013，28（1）：56-59.
[5] 应康，王玉珍.丹皮酚对小鼠淋巴细胞转化的影响[J].包头医学院学报，2001，17（2）：92-93.
[6] 张永梅，梁红，杨玉梅，等.丹皮酚对小鼠免疫功能的影响[J].包头医学院学报，2001，19（4）：261-264.
[7] Sun GP， Wang H， Xu SP， et al. Anti-tumor effects of Paeonol in a HepA-hepatoma bearing mouse model via induction of tumor cell apoptosis and stimulation of IL-2 and TNF-α production [J]. Eur J Pharm，2008，584：246-252.
[8] Wang JJ， Li QW， Ou YT，et al. Immunoregulation effect of recombinant adenoviral mediated human lactoferrin gene on mice bearing EMT6 breast cancer[J].J Pharm Res，2010，3（9）：2131-2133.
[9] 童明宏，邵俊，陈燕红，等.CD3+、CD4+、CD8+T细胞水平在胃癌患者外周血中的变化[J].检验医学，2012，27（6）：445-447.
[10] Abbas AK， Andrew H. Cellular and Molecular Immunology[M].5版.北京：北京大学医学出版社，2005：401-410.
[11] 江益平，马方励，周联，等.香菇多糖对免疫抑制小鼠肠道派氏结T细胞的影响[J].中国药理学通报，2011，27（9）：1236-1239.
[12] Hung K， Hayashi R， Lafond-Walker A， et al. The Central Role of CD4+ T Cells in the Antitumor Immune Response[J]. J Exp Med，1998，188（12）：2357-2368.
[13] 刘红云，马丽萍，魏菁，等.小鼠调节性T细胞的CD4+CD25+CD127low/-标记分析[J].中国实验血液学杂志，2012，20（6）：1469-1473.
[14] Yu N， Li X， Song W， et al. CD4 （+）CD25 （+）CD127 （low/-）T cells：A more specific treg population in human pe-ripheral blood[J]. Inflammation，2012，35（6）：1773-1780.
[15] Tamada K， Chen L. Renewed interest in cancer immunotherapy with the tumor necrosis factor superfamily molecules[J]. Cancer Immunol Immunother，2006，55：355-362.
[16] 徐月清，许光辉，牛培，等.杏花雨注射液对荷瘤小鼠血清IL-2、TNF-α水平的影响[J].医学研究与教育，2011，28（1）：5-7.
（收稿日期：2013-01-17 本文编辑：卫 轲）