打开文本图片集
【摘要】目的：探讨微波辐射导致的雄小鼠生殖功能障碍的中医证候。方法：应用以方测证法研究，即通过循证医学确定男性不育症临床证候并遴选代表方剂，应用这些方剂治疗微波辐射性生殖功能障碍雄小鼠，通过精子总活率、快速向前精子率、畸形率及睾丸病理改变判断疗效，依据疗效判断证候。结果：无论是基准辐射，还是加功辐射、加时辐射，金匮肾气丸对其全部精液参数都有显著疗效，同时，金匮肾气丸还可以改善微波辐射损伤小鼠睾丸组织病变；其他方剂仅对部分精液参数有疗效，而且对辐射损伤睾丸的病理变化无改善。结论：微波辐射性雄小鼠生殖功能障碍的证候是肾阳虚证。
【关键词】微波；电磁辐射；男性生殖功能障碍；肾阳虚证；金匮肾气丸
【中图分类号】R256.56【文献标志码】A
微波辐射严重地危害着人们的健康。生殖系统是微波辐射敏感的靶器官，持续地微波辐射可以导致男性不育症[1]。中医药对微波辐射导致的男性不育症有很好的防治作用[2-4]，但目前大多是应用单方对症治疗。辨证论治是中医理论与临证实践的完美结合，与单方对症治疗相比辨证论治能解决更复杂的临床问题，因此微波辐射导致的男性不育症的中医证候学研究意义重大。本课题组曾对具有微波辐射职业暴露史之男性不育症患者进行症状观察及证候分析，探讨了其中医证候特点，发现随着辐射时间延长，患者最终表现为肾精亏虚证[5，6]，但由于男性不育症病因复杂，这些患者除微波损伤外，还可能存在其他病因，因此，微波辐射职业暴露患者表现出的证候并不单纯，其证候往往不是微波辐射性男性不育症的真实证候。为此，本课题组进行动物实验，利用动物实验的可控性，研究单纯微波辐射所致的真实证候。
1材料
11动物
选清洁级8周龄健康雄性BALB/C小鼠250只，体重20～30g，由大连医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（辽）2008-0002。在我校实验室进行环境适应一周，适应期间照明采用12h明/暗周期（早7：00至晚7：00）。自由饮水进食，二级喂养。之后进入实验。
12主要仪器
微波治疗仪（徐州市万诺医疗设备有限公司生产，KJ-6200B型）、微波泄露检测仪（美国ETS-Lindgren生产，HI-1501型）、电子天平AR1140（奥豪斯公司授权，梅特勒-托利多仪器上海有限公司制造，产品标准号：JB/T5374-1991）、共聚焦显微镜（日本Nikon （ECLIPSE） Ti-E）、YTD-2002系列医学影像工作站（徐州市永泰电子科技有限责任公司生产，注册证书编号：苏药管械（试）字2004第2060065号）、YFY电煎密闭型单体煎药机（北京东华医疗设备有限公司生产）等。
13药物
金匮肾气丸（北京同仁堂生产，批准文号：国药准字Z11020147，生产批号：1032442，生产日期：20110926），小鼠每日每公斤体重用药量02g；十全大补丸（北京同仁堂生产，批准文号：国药准字Z11020068，生产批号：1033417，生产日期：20110704），小鼠每日每公斤体重用药量036g；龙胆泻肝丸（北京同仁堂生产，批准文号：国药准字Z11020653，生产批号：1082140，生产日期：20111125），小鼠每日每公斤体重用药量024g；柴胡疏肝丸（营口宏升药业有限公司生产，批准文号：国药准字Z21020070，产品批号：20110117，生产日期：20110115），小鼠每日每公斤体重用药量04g。上述小鼠用药量即为成人（按50kg计）临床每日每公斤体重用药量。
左归丸（《景岳全书》）、少腹逐瘀汤（《医林改错》）、苍附导痰丸（《叶天士女科诊治秘方》）三方没有成药，故将其分别按原方用量水煎制成煎剂，即每个方取525g生药加水，通过YFY电煎密闭型单体煎药机煎制，设文火（100℃），持续煎1h，煎出药液2000mL。成人临床用药每日200mL，体重按50kg计算，即0004mL/g体重，故小鼠用药量每日每克体重0004mL。
2方法
应用“以方测证”法进行小鼠的证候研究。“以方测证”法：即通过文献进行循证医学研究，总结男性不育症临床证候及代表方剂，用不同的代表方治疗微波辐射性生殖功能障碍雄小鼠，观察疗效并进行证候研究。有效方剂所代表的证候就是微波辐射损伤性雄小鼠生殖功能障碍的证候。
21动物分组及施加因素
雄性BALB/C小鼠250只，随机分为25组，每组10只。
平行对照组：选小鼠10只。仅将小鼠置于微波治疗仪下，不开机照射，但均要抓取一次，以保证和辐射对照组及治疗组的小鼠饲养条件相同，不做任何治疗。
基准造模分组研究：选小鼠80只，进行基准造模。即将小鼠分别暴露于频率为2450MHz连续微波中，功率密度为10mW/cm2，辐射18d，每天辐射1h[7]。将基准造模的80只小鼠分为8组，即：①基对组10只，生理盐水分别灌胃。②基金组10只，金匮肾气丸分别灌胃。③基左组10只，左归丸分别灌胃。④基十组10只，十全大补丸分别灌胃。⑤基龙组10只，龙胆泻肝丸分别灌胃。⑥基柴组10只，柴胡疏肝散分别灌胃。⑦基少组10只，少腹逐瘀汤分别灌胃。⑧基苍组10只，苍附导痰汤分别灌胃。
加功造模分组研究：选小鼠80只，增加功率密度进行造模，即在基准造模其他条件不变基础上，将其功率密度增至为40mW/cm2。将加功造模的80只小鼠分为8组，即：①功对组10只，生理盐水灌胃。②功金组10只，金匮肾气丸分别灌胃。③功左组10只，左归丸分别灌胃。④功十组10只，十全大补丸分别灌胃。⑤功龙组10只，龙胆泻肝丸分别灌胃。⑥功柴组10只，柴胡疏肝散分别灌胃。⑦功少组10只，少腹逐瘀汤分别灌胃。⑧功苍组10只，苍附导痰汤分别灌胃。
加时造模分组研究：选小鼠80只，增加辐射时间进行造模，即在基准造模其他条件不变基础上，将其辐射时间增至每天4h。将加时造模的80只小鼠分为8组，即：①时对组10只，生理盐水分别灌胃。②时金组10只，金匮肾气丸分别灌胃。③时左组10只，左归丸分别灌胃。④时十组10只，十全大补丸分别灌胃。⑤时龙组10只，龙胆泻肝丸分别灌胃。⑥时柴组10只，柴胡疏肝散分别灌胃。⑦时少组10只，少腹逐瘀汤分别灌胃。⑧时苍组10只，苍附导痰汤分别灌胃。
22小鼠精子参数测定及睾丸病理变化
取上述小鼠脱颈处死，先用电子天平测重并记录，迅速剖开附睾及附睾管，用01mL生理盐水冲洗，滴于2份载玻片上，1份用YTD-2002系列医学影像工作站精子检测仪检测精子活率，另1份伊红染色，观察畸形精子，计算畸形率。对各实验组小鼠进行精子总活率（PR+NP）、快速向前精子率（PR）和精子畸形率测定。
取上述小鼠睾丸（每只小鼠各取1只），先用电子天平测重并记录，以便之后计算睾体比；之后迅速将睾丸置于10%福尔马林中，固定24h，石蜡包埋，HE染色，切片，光镜观察组织形态学改变。
对小鼠精子PR+NP、PR、精子畸形率、睾体比及睾丸病理学改变进行比较。首先对基准造模、加时造模、加功造模及平行对照组之间的疗效进行比较研究，以判断不同辐射量对小鼠生殖功能影响程度；之后，对基准造模、加时造模、加功造模各组组内及组间进行比较研究，判断有疗效的组分，以确定证候。
23统计学方法
所有数据均采用Stata120版统计软件进行分析，各组检测结果以（±s）表示。多样本比较，首先采用方差分析，在方差分析中，通过bartlett的卡方值来检验等方差假设，然后再用kruskal-wallis检验，进一步检验均值（中位数）相等的原假设。两样本均数比较首先采用t检验，无论是双边检验，还是单边检验，显著性水平一律取5%。
3结果
31各组小鼠精液参数及睾体比
311不同微波辐射对小鼠精液参数及睾体比的影响4组方差分析差异显著，基对组、功对组、时对组均可以使小鼠精子PR+NP、PR显著低于正常，畸形率显著高于正常；对PR+NP、畸形率，时对组和功对组与基对组均未见显著差异；对PR，时对组显著低于基对组，功对组却显著高于基对组，时对组明显低于功对组。在基对组、时对组时睾体比没有显著改变，但功对组睾体比显著变小，即可以导致睾丸萎缩。见表1。
312不同药物对基准微波辐射小鼠精液参数及睾体比的影响各组PR+NP、PR、畸形率的参数进行方差分析差异显著。7个药物治疗组PR+NP均值最高者是基金组，只有金匮肾气丸明显提高了精子总活率，并且使之恢复了正常。PR均值最高者是基金组，金匮肾气丸、龙胆泻肝汤皆明显提高了快速向前运动精子率，但金匮肾气丸最好，并且使之恢复了正常。畸形率均值最低者是基金组，金匮肾气丸、龙胆泻肝汤、左归丸均降低精子畸形率，但没有恢复正常。各组睾体比进行方差分析，没有显著差异，表明基准微波辐射对小鼠睾丸重量没有影响，用药与否仍然无差别，kruskal-wallis检验，睾体比中位数全相等，无差异。见表2。
313不同药物对加功微波辐射小鼠精液参数及睾体比的影响加功各组PR+NP、PR、畸形率的参数进行方差分析有差异。7个药物治疗组PR+NP均值最高者是功金组，金匮肾气丸、柴胡疏肝散、左归丸、十全大补汤、苍附导痰汤治疗皆有效，提高了精子总活率，但金匮肾气丸最好，治疗后使之恢复了正常；其他虽有效，但没有恢复正常。PR均值最高者是功柴组，功金组位于第二，柴胡疏肝散及金匮肾气丸都能提高了快速向前运动精子率，并且使之恢复了正常，二者没区别。畸形率均值最低者是功金组，金匮肾气丸、左归丸、十全大补丸能降低精子畸形率，但没有使之恢复正常。对平行对照组、功对组及7个药物治疗组睾体比进行方差分析有差异，对功对组与7个药物治疗组睾体比进行方差分析无明显差异，但应用kruskal-wallis检验发现7个治疗组的睾体比中位数不全相等，有差异。对7个药物治疗组睾体比进行方差分析无明显差异，但是kruskal-wallis检验发现7个治疗组的睾体比中位数不全相等。7个药物治疗组睾体比均值最高者是功金组，只有金匮肾气丸治疗有效，提高了高强度微波辐射小鼠的睾体比，实际上是修复了加功微波辐射引起的小鼠睾丸萎缩，治疗后并且恢复了正常。见表3。
314不同药物对加时微波辐射小鼠精液参数及睾体比的影响加时各组PR+NP、PR、畸形率的参数进行方差分析有显著差异。7个药物治疗组PR+NP均值最高者是时金组，金匮肾气丸、柴胡疏肝散、左归丸、苍附导痰汤、龙胆泻肝汤、十全大补丸、少腹逐瘀汤皆能提高了精子总活率，其中金匮肾气丸疗效最好并且使之恢复了正常，其他虽有效，但未恢复正常。PR均值最高者是时金组，金匮肾气丸、柴胡疏肝散、左归丸、苍附导痰汤、龙胆泻肝丸、十全大补丸都能提高了快速向前运动精子率，其中金匮肾气丸、柴胡疏肝散疗效最好，可以使之恢复正常，但左归丸、苍附导痰汤、龙胆泻肝丸、十全大补丸作用不大，不能恢复正常。畸形率均值最低者是时金组，金匮肾气丸、十全大补丸、柴胡疏肝散都能降低精子畸形率，上3种药皆不能使畸形率恢复正常。各组睾体比进行方差分析没有显著差异，kruskal-wallis检验，睾体比中位数全相等，也无差异，表明加时微波辐射对小鼠睾丸重量没有影响，用药与否仍然无差别。见表4。
32病理改变
平行对照组小鼠睾丸的生精小管界膜完整平坦，生精小管内可见成熟精子，各类生精细胞排列整齐，层次清楚，间质细胞结构正常（图1）。
基准对照组小鼠睾丸生精小管上皮排列疏松，各类生精细胞排列不整齐，层次不清楚，部分生精小管内生精上皮变薄，甚至生精小管管腔断裂，精原细胞形态基本正常，支持细胞、精母细胞、精子细胞变性、坏死脱落，生精小管管腔内可见蛋白水肿液和脱落细胞，精细数目明显减少（图2）。基金组小鼠睾丸的生精小管界膜完整平坦，生精小管内可见成熟精子，各类生精细胞排列整齐，层次清楚，间质细胞结构正常（图5）；基苍组（图3）、基柴组（图4）、基龙组（图6）、基少组（图7）、基十组（图8）、基左组（图9）未见明显改善。
图1平行对照组（HE，×200）图2基对组（HE，×200）图3基苍组（HE，×200）图4基柴组（HE，×200）图5基金组（HE，×200）图6基龙组（HE，×200）图7基少组（HE，×200）图8基十组（HE，×200）图9基左组（HE，×200）加时对照组小鼠睾丸精原细胞肿胀，偶见精原细胞溶解、消失。可见较多的精母细胞完全变性、坏死、脱落，结构正常的精母细胞也可见连接松散，失去正常的细胞序列，出现细胞排列紊乱，精细胞变性、坏死、脱落，精子极少，多数生精细胞管腔内无精子细胞存在（图10）。时金组小鼠睾丸的生精小管界膜基本完整平坦，生精小管内可见成熟精子，各类生精细胞排列较为整齐，层次较为清楚，间质细胞结构基本正常（图13）；时苍组（图11）、时柴组（图12）、时龙组（图14）、时少组（图15）、时十组（图16）、时左组（图17）未见明显改善。
加功对照组小鼠睾丸的精原细胞也出现肿胀，也可见溶解、消失。精母细胞完全变性、坏死、脱落，结构正常的精母细胞也可见连接松散，失去正常的细胞序列，出现细胞排列紊乱，精细胞变性、坏死、脱落，偶见精子，多数生精细胞管腔内无精子细胞存在（图18）。功金组小鼠睾丸的生精小管界膜基本完整平坦，生精小管内可见成熟精子，生精细胞排列较为整齐，层次清楚（图21）；功苍组（图19）、功柴组（图20）、功龙组（图22）、功少组（图23）、功十组（图24）、功左组（图25）未见明显改善。
图10时对组（HE，×200）图11时苍组（HE，×200）图12时柴组（HE，×200）图13时金组（HE，×200）图14时龙组（HE，×200）图15时少组（HE，×200）图16时十组（HE，×200） 图17时左组（HE，×200）图18功对组（HE，×200）图19功苍组（HE，×200）图20功柴组（HE，×200）图21功金组（HE，×200）图22功龙组（HE，×200）图23功少组（HE，×200）图24功十组（HE，×200）图25功左组（HE，×200）33证候判定
无论是基准辐射，还是加功辐射、加时辐射，金匮肾气丸对其全部精液参数都有显著疗效，同时，金匮肾气丸还可以改善微波辐射损伤的小鼠睾丸组织病变；其他方剂仅对部分精液参数有疗效，而且对辐射损伤睾丸的病理变化无改善，因此，微波辐射性雄小鼠生殖功能障碍的证候是肾阳虚证。
4讨论
中医临床用药，离不开辨证论治，中医证候对中医临床至关重要[8]。经验表明，中医中药治疗微波辐射性男性不育症有效，但只有辨清微波辐射性男性不育症的证候，才能更好地指导临床用药，才能有更好的疗效。男性不育症病因十分复杂性，至今能明确病因者仅占约251%。由于多种致病原因的存在，临床中很难弄清单纯的微波辐射所致的证候。动物实验是可控的，从科学方法上研究单纯的微波辐射损伤是可行的；电磁辐射具有损伤性，应用实验动物来研究，从伦理上都是合理的。但是，如何判断动物的证候则是困难的。中医的证候来自临床，由四诊得出，而动物不能用语言表达感受，加之解剖差异，四诊难以应用，因此按照人的辨证方法进行实验动物辨证是极为困难的；从实验动物的行为表现去判断证候，则容易导致的伪科学结论。“以方测证”是动物实验中判断证候的最佳方法，“用是方，有是效，便有是证”，将不同证型的代表方分别治疗损伤动物，从疗效来判定确定证型。本研究首先通过循证医学方法确定男性不育症临床证候，遴选代表方剂，并应用这些方剂治疗微波辐射损伤小鼠。实验表明，金匮肾气丸对所以微波辐射组的全部指标疗效都显著，表明微波标准辐射导致的证候是肾阳虚证。
流行病学研究表明，人们受到电磁辐射（非电离辐射）伤害后，往往出现头晕、神疲体倦，少气乏力、自汗、易感冒等，此乃肺气虚弱之象，还会出现心悸、气短等心气虚之象；照射严重者可有食欲不振、食后腹胀，甚至恶心、呕吐等症状，此乃脾胃气虚之征；再重时，则出现失眠、耳鸣、记忆力减退、性功能减退等临床症状，此乃肾精受损之候。精乃气之精，肾精亏虚乃肾气虚之甚。人们还发现电磁场职业暴露者往往脉率迟缓，即出现中医的“迟脉”[9-11]，表明不仅伤气，而且还伤阳，为阳气虚衰，无力推动气血运行之象。据电离辐射的临床研究，全身外照射急性放射病的症状及体征有呕吐、腹泻、乏力、头晕、失眠、嗜睡、食欲减退、恶心、脱发、精神萎靡、出血等[17]，这种辐射损伤砍伐阳气，伤及肺心脾肾，甚至出现气虚不固出血之症。
微波乃电磁波的一种。从中医理论看，电磁波乃六气之属，为火热之气，常则养人；电磁辐射乃六淫之属，为火热之邪，过则为灾[12]。电磁波“在天为热，在地为火”，正常的电磁场强度对人有益，《黄帝内经·素问·阴阳应象大论》中有“少火之气壮”、“少火生气”，此乃火热之气的生理功能，即“常则养人”。但电磁场过强，作为一种辐射源，火热之太过则为邪气，可对人体造成伤害，即“热伤气”，“壮火食气…壮火散气”，“壮火之气衰”，辐射伤气“过则为灾”，此乃微波辐射的基本病机。《黄帝内经·素问·痿论》中有“逢大热而渴，渴则阳气内伐，内伐则热舍于肾”，微波辐射之火热外邪致病可致肾的阳气虚弱。
参考文献
[1]Chia SE，Tay SK.Occupational risk for male infertility：a case-con-trol study of 218 infertile and 227 fertile men.J Occup Environ Med，2001，43（11）：946-951.
[2]毕焕洲.黄精饮治疗电磁辐射性男性不育症临床研究.中医药学报，2008，36（5）：55-56.
[3]毕焕洲.四海护精方治疗微波辐射性男性生殖功能障碍临床研究.中国性科学，2009，18（10）：9-11.
[4]毕焕洲.海龙黄精散治疗微波职业暴露男性不育症的临床观察.北京中医药大学学报，2012，35（4）：281-283.
[5]毕焕洲.男性不育症中医证候与微波辐射职业暴露相关性.中医杂志，2012，53（3）：231-232.
[6]毕焕洲，朱明，孙景环，等.微波辐射损伤所致男性不育症的中医证候特点分析.中国中医药科技，2011，18（6）：518-520.
[7]任东青，杨文清，曾桂英，等.2450MHz微波辐照对雄性小鼠生殖系统的影响.中国临床康复， 2002，6（6）：822-823.
[8]毕焕洲，孙景环，王明霞.男性不育症的中医证候研究.光明中医，2012，27（5）：849-851.
[9]王德文，彭瑞元.电磁辐射的损伤与防护.中华劳动卫生职业病杂志，2003，21（5）：321.
[10]Fedorowski A， Steciwko A. Biological effects of non-ionizing electromagnetic. Med Pr， 1998， 49（1）： 93
[11]柯文棋，褚新奇，李振杰，等.船舶电磁辐射环境对船员健康和作业能力的影响.中华航海医学与高气压医学杂志，2007，14（1）：3-7.
[12]毕焕洲.电磁辐射损伤火热病机论.中国中医基础医学杂志，2011，17（5）：576-578.
（收稿日期：2014-07-16）