[摘要] 该文旨在研究六味五灵片对小鼠急性乙醇肝损伤的保护作用，并初步探讨其作用机制。实验将C57BL/6小鼠随机分成7组，即空白对照组，模型组，阳性药联苯双酯组（150 mg·kg-1），六味五灵片极低、低、较高、高剂量组（0.1，0.5，4，8 g·kg-1）。采用改良的造模方法（给药4 d后给予56%乙醇，6 g·kg-1灌胃2次，12 h/次）建立小鼠急性肝损伤模型。检测小鼠血清中ALT，AST活性及肝组织中MDA，TG，TNFα，IL1β的含量和GSH，SOD的活性；HE和油红O染色，观察肝组织病理学变化。结果显示，与模型组相比，六味五灵片各剂量组均能显著降低血清ALT，AST的含量（P<0.05），提高GSH，SOD活性，减少肝组织MDA，TG的生成，降低肝组织中TNFα，IL1β的含量（P<0.05），且呈一定剂量依赖关系。同时，HE和油红O染色结果表明，六味五灵片可显著改善乙醇引起的肝细胞肿胀度，水样变性和脂滴形成等肝组织损伤。结果表明，六味五灵片对急性乙醇肝损伤具有较好的保护作用，其保护机制可能与减轻脂质过氧化，提高抗氧化酶活性，抑制氧化应激和炎症因子过表达相关。
[关键词] 乙醇性肝损伤； 六味五灵片； 保肝作用； 抗氧化
乙醇性肝病（alcoholic liver disease， ALD）为长期过量饮酒所导致的肝脏损伤性疾病[12]。近年来，ALD发病率也呈逐年升高趋势[34]。经消化道吸收的乙醇90%以上经肝脏代谢，当长期或大量饮酒后，大量的乙醇在肝脏氧化，会产生过多的氧化应激产物加重肝脏损伤；肝脏内的Kupffer细胞被激活，从而促进肝细胞调亡[56]。
六味五灵片（LWWL）是解放军第三〇二医院研发的制剂，由五味子、女贞子、莪术、连翘、灵芝孢子粉及苣荬菜等中药组成[78]，主要功效为滋肾养肝，活血解毒，用于治疗慢性乙型肝炎导致的氨基转移酶升高等。己有研究表明[910]，LWWL对乙醇性肝损伤有较好的临床疗效，但目前LWWL对乙醇性肝损伤的保护作用的机制不明确。故本研究以小鼠急性乙醇性肝损伤为模型，评价LWWL对小鼠急性乙醇性肝损伤的保护作用并初步探讨其作用机制。
1 材料
1.1 动物 C57BL/6小鼠，雌性，体重（20±2）g，SPF级，购自军事医学科学院实验动物中心，合格证号SCXK（军）20120004。饲养于解放军三〇二医院实验动物中心，自由饮水进食，适应性喂养1周。
1.2 药物 LWWL购自山东世博金都药业有限公司（批号151105），批准文号Z20060238；联苯双酯滴丸购自解放军三〇二医院药学部（批号15070102），厂家北京协和药厂，批准文号H11020980。
1.3 试剂 ALT，AST，丙二醛试剂盒购自南京建成生物工程研究所；SOD，总谷胱甘肽试剂盒购自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所。小鼠TNFα，IL1β酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自美国eBiosience公司；56度二锅头由北京红星酒业有限公司提供。
1.4 仪器 SynergyTMH1多功能酶标仪（Bio Tek，USA）；KQ500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；恒温二氧化碳培养箱（NAPCO）；PL602L电子天平[梅特勒托利多仪器（上海）有限公司]；Nikon E200光学显微镜；Mini6k微型离心机（杭州奥盛仪器有限公司）；Leica2016石蜡切片机（上海莱卡仪器有限公司）；HC3018R高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）。
2 方法
2.1 实验分组 84只C57BL/6小鼠适应性喂养1周后随机分成7组，每组12只，分别为空白对照组，模型组，阳性药联苯双酯组（150 mg·kg-1），LWWL极低剂量、低剂量、较高剂量、高剂量组（0.1，0.5，4，8 g·kg-1）。
2.2 给药 阳性药联苯双酯及LWWL临用前粉碎，用蒸馏水超声溶解配成所需浓度。各给药组用等体积不等浓度灌胃给药，1 d给药1次，连续给药4 d，空白对照组、模型组给予蒸馏水，容量为10 mL·kg-1·d-1。
2.3 动物造模 小鼠急性乙醇肝损伤模型参考INA BERGHEIM等[1112]方法改良后所建立的造模方法。即末次给药2 h后，除空白对照组给予蒸馏水外，其余各组小鼠均灌胃乙醇（6 g·kg-1）12 h 1次，连续灌2次。
2.4 标本采集 末次乙醇灌胃后禁食不禁水，12 h后摘眼球取血，室温静置2 h后，3 000 r·min-1离心15 min，吸取上层血清，于-80 ℃保存，用于血清中ALT，AST含量测定；同时分离肝脏右叶置于4%甲醛溶液中固定，用于HE和油红O染色，剩余肝脏保存于-80 ℃，用于生化指标GSH，SOD，甘油三酯（TG），MDA的含量测定。
2.5 指标检测 取小鼠血清，按试剂盒说明书测定ALT，AST；取10%肝脏匀浆液，均按试剂盒说明书进行肝脏中SOD，GSH，MDA，TG的测定；ELISA法测定肝组织中TNFα和IL1β的含量。
2.6 肝组织病理形态学观察 用4%多聚甲醛固定肝组织，常规石蜡包埋切片，HE和油红O染色，并在光学显微镜下观察。
2.7 统计方法 实验数据以±s表示，采用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析（ANOVA）。
3 结果
3.1 一般状况 实验期间空白对照组小鼠毛发光泽，活动正常，精神状态、进食以及排便情况未见异常；模型组的小鼠给酒后出现步态不稳，昏睡等症状，进食量减少；LWWL各剂量组对造模小鼠精神状态、饮食、大便及毛发等情况均有不同程度的改善。
3.2 LWWL对急性乙醇肝损伤小鼠血清ALT，AST的影响 模型组血清中的AST，ALT较空白对照组显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）；与模型组相比，除LWWL低剂量组外，小鼠血清中ALT均显著降低；LWWL各剂量组小鼠血清中AST均显著降低（P<0.05）。结果表明LWWL可显著降低由乙醇造成的小鼠血清中AST和ALT的升高，并呈现出一定的剂量依赖关系（图1）。
3.3 LWWL对急性乙醇肝损伤小鼠肝脏中SOD，MDA，GSH，TG的影响 模型组的SOD，GSH活性明显低于空白对照组（P<0.01）；与模型组相比，LWWL给药组的SOD和GSH具有升高趋势；模型组的MDA和TG含量显著高于空白对照组（P<0.01），LWWL各剂量组的MDA和TG明显降低（P<0.01，P<0.05）并呈剂量依赖性趋于正常（图2）。
3.4 LWWL对急性乙醇肝损伤小鼠肝脏TNFα，IL1β含量的影响 模型组的TNFα明显高于空白对照组（P<0.01），与模型组相比LWWL 4个剂量组的TNFα均明显降低（P<0.01，P<0.05）；模型组的IL1β明显高于空白对照组（P<0.01），与模型组相比LWWL 4个剂量组的IL1β均明显降低（P<0.01，P<0.05）（表1）。
3.5 LWWL对急性乙醇肝损伤小鼠肝脏组织病变的影响 乙醇灌胃后处死动物，肝脏标本经甲醛固定，石蜡包埋，HE染色。结果表明，空白对照组小鼠肝脏未见明显病变，模型组中央静脉和小叶间静脉周围出现肝细胞肿胀，水样变性等病理改变，部分肝细胞脂肪变性；汇管区小叶周边充血和有大量炎细胞浸润，偶见碎屑状坏死（图3 B中箭头所示），提示造模成功；与模型组比较，LWWL各剂量组的病变程度明显减轻，肝细胞再生明显，但肝细胞仍然存在一定程度的水肿、脂肪变性，汇管区少量炎细胞浸润（图3）。
3.6 LWWL对急性乙醇肝损伤小鼠肝脏脂滴表达的影响 油红O染色后，空白对照组无脂滴聚集，模型组有大量染成红色的脂滴形成（图4 B中箭头所示），阳性药联苯双酯组染成红色的脂滴减少；LWWL组脂滴减少明显，且随剂量增加，减少趋势更加显著（图4）。
4 讨论
人体摄入的乙醇90%～95%经肝脏代谢，过量乙醇导致氧化应激，引起细胞器和酶的结构改变，导致肝细胞损伤；同时抑制谷胱甘肽（GSH）的合成，减弱超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化功能；又可引起脂质过氧化反应[1314]，从而产生大量丙二醛（MDA）等氧化物或过氧化物；同时过量乙醇会减弱脂肪酸氧化造成三羧循环障碍从而影响脂肪代谢，致使脂肪在肝细胞内沉积；还能刺激免疫系统，激活枯否细胞，产生参与了肝脏炎症的发生、肝细胞的坏死和凋亡的细胞因子TNFα，IL1β等[1516]。联苯双酯是我国临床常用的保肝降酶药物，对肝损伤有明显保护作用[1719]。临床和基础研究表明联苯双酯对于乙醇性肝损伤具有一定的疗效，故本实验选其作为阳性药[2021]。
有研究表明，LWWL富含多种有效成分，可有效地清除导致肝细胞氧化损伤的过氧化物和自由基，同时还具有修复受损肝细胞和促进肝细胞再生的功能[2224]。本研究表明，LWWL各剂量组均能降低血清ALT，AST含量，提高GSH，SOD活性，减少肝组织MDA，TG的生成，降低肝组织中TNFα，IL1β含量，且呈剂量依赖关系，明显改善肝组织损伤的程度，与模型组比较差异有统计学意义。HE和油红O染色表明LWWL给药可以显著改善肝细胞肿胀，水样变性，脂滴形成等组织病理学损伤。说明LWWL对ALD具有较好的疗效，特别是在保护肝细胞、促使肝功能恢复等方面均具有显著疗效。
综上所述，LWWL对乙醇诱导的小鼠急性肝损伤具有显著的保护作用，表现为降低血清中的转氨酶、抑制甘油三酯在肝脏的蓄积、显著改善肝细胞肿胀和水样变性等。其作用机制可能与减轻脂质过氧化，提高抗氧化酶活性，抑制氧化应激和炎症因子过表达相关。本研究为进一步评价LWWL对乙醇性肝损伤的临床疗效提供了重要的实验依据，同时也为乙醇性肝病的治疗提供了新的方法和策略。
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[责任编辑 马超一]