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摘 要：通过试验研究杠板归不同层提取物对不同龄黄粉虫的麻醉活性及体质量变化的影响，结果表明，石油醚层萃取物对3、8龄黄粉虫的麻醉活性最好，当浓度为4 mg·mL-1时，处理3 min时校正麻醉率均为100%，LC50分别为0.008 3和0.058 9 mg·mL-1；同时，石油醚萃取物0.5 mg·mL-1对3龄黄粉虫的平均体质量增长的抑制作用最明显，体质量平均增长率在16 d内比对照低了2.9%，且与对照达到极显著水平。研究结果表明杠板归对黄粉虫的麻醉及其体质量增长抑制的活性成分为低极性的化合物。
关键词：杠板归提取物；黄粉虫；麻醉活性；体质量变化
中图分类号：R285.5 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.06.022
Abstract： Biological activity of five extracts of P. perfoliatum was determined on anesthetic activity and weight changing of T. motlitorlin. The research results showed that the anesthetic activity of extracts of petroleum against 3rd and 8th instars larvae of T.motlitorlin possesses significant activity. When its concentration was 4 mg·mL-1， the corrected rate of anesthesia of 3rd and 8th instars larvae of T. motlitorlin in 3 min was 100%. P.E. extracts against 3rd and 8th instars larvae of T. motlitorlin exhibited anesthesia activity with LC50 values of 0.008 3 and 0.058 9 mg·mL-1， respectively. At the same time， for the inhibition of weight gaining of instars larvae of T. motlitorlin， the most obvious effect against 3rd instars larvae of T. motlitorlin was observed at 0.5 mg·mL-1 of P. E. extracts， and inhibition of insects average growth rate of weight was 2.9% lower than the control"s in 16 days， and reached extremely significant level with the control. These results suggested that compounds of the anesthetic and inhibition of weight growth belonged to compounds of the lower polarity.
Key words： extracts of P. perfoliatum L.； T.motlitorlin （L.）； anesthetic activity； weight change
蓼属（Polygonum）是蓼科植物中的药用大属，主要分布于北温带。我国约有120 种，其中近80 种供药用，分布于全国各地，蓼属大多具有清热解毒、散结消肿、活血止痛、顺气解痉、收敛止泻、通经利尿等功效[1]。此外，该属植物还具有杀虫、昆虫拒食、驱避以及抗菌等活性。杠板归为蓼属一年生攀援草本植物，又名贯叶蓼、蛇牙草等。目前已从杠板归中分离得到的天然化合物有黄酮及苷类共13种、4个蒽醌类化合物、9个萜类化合物、12种酚羧酸类化合物、5个新苯丙素糖酯类化合物、3个酰胺类化合物等众多类型的化合物[2-9]。活性研究表明，杠板归具有抗炎、抗疱疹病毒、抗肿瘤、止咳、杀虫等活性作用[10-13]。为更好地开发利用这一重要的传统草药资源，本试验以黄粉虫为试虫，以杠板归不同层提取物的麻醉活性及其对生物体重变化的影响为筛选指标，寻找杠板归的有效部位或活性化合物。本研究旨在为系统研究杠板归的活性成分及开发杠板归的药用价值提供活性依据。
1 材料和方法
1.1 材 料
1.1.1 供试植物 杠板归全草于2012年采自河北雾灵山，经河北科技师范学院生命科技学院徐兴友博士鉴定为杠板归（Polygonum perfoliatum L.）。将阴干的500 g杠板归全草粉碎，过孔径为0.187 5 mm的筛，备用。
1.1.2 供试昆虫 黄粉虫[Tenbrio motlitorlin （L.）]幼虫由河北科技师范学院生命科技学院植物保护实验室提供。选取健康、大小一致、体质量相近、发育正常的3、6、8龄幼虫用于麻醉活性和体质量变化情况的测定。
1.1.3 主要仪器 JA1203电子天平（上海精科天平制造厂）、HH-8数显恒温水浴锅和HDM电子调温电热套（江苏金坛荣华仪器制造有限公司）、KH-100B超声波清洗器（江苏昆山禾创超声波仪器有限公司）、GG17旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）、FZ-102高速粉碎机（河北省黄骅市齐家务科学仪器厂）和SHZ-D（Ⅱ） 循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）。
1.2 方 法
1.2.1 样品的制备 用90%乙醇加热回流提取3次，每次3 h；再用70%乙醇加热回流提取2次，每次3 h；合并提取滤液，减压浓缩成浸膏，即杠板归粗提物（Crude）（204 g）。粗提物用水分散后分别依次用石油醚（PE）、乙酸乙酯（EtoAc）、正丁醇（BuOH）各萃取7次，萃取液分别减压蒸馏，浓缩后依次得到PE层浸膏8.879 g，EtoAc层浸膏7.191 g，BuOH层浸膏11.016 g，取水层液置于蒸发皿中加热浓缩至浸膏31.787 g，所得材料备用。
1.2.2 活性测定 （1）麻醉活性的测定。将杠板归粗提物、PE、EtoAc、BuOH、水层萃取物用20%乙醇溶液分别配制成0.25，0.5，1，2，4 mg·mL-1系列浓度药液。在培养皿中放置2层滤纸，喷水保湿，将靶标物黄粉虫在药液中浸泡5 s，然后放入培养皿中观察，每个浓度药液3次重复，每重复10条黄粉虫。对照组黄粉虫用20%乙醇溶液处理，在各处理后的2 h内密切检查试虫麻醉情况，于3，5，10，20，30，40，60，90 min检查试虫麻醉数，虫体平直、完全瘫软、镊子尖刺其尾部，试虫无反应者为麻醉。
（2）对黄粉虫的体质量的影响。将杠板归粗提物、PE、EtoAc、BuOH、水层萃取物用20%乙醇溶液分别配制成0.25，0.5，1，2，4 mg·mL-1系列浓度药液。每处理用电子天平称取2 g黄粉虫饲料放入培养皿中，然后向每个培养皿中加入3 mL上述药液搅拌均匀后晾干，将体质量大小一致的10条黄粉虫幼虫（记录黄粉虫原始体质量）放在培养皿中喂食，每处理重复3次，每重复10条黄粉虫。对照组用20%乙醇溶液处理，每隔2 d称量黄粉虫体质量，记录其16 d内的体质量变化，并画出体质量变化趋势线。
1.2.3 数据处理 利用STATA SE 12 软件进行麻醉活性的meta分析[计数资料用比值比（Odds ratio， OR）表示，用95%的可信区间（Confidence interval， CI） 表达]和DPS7.05版软件对黄粉虫的麻醉和体质量变化情况做显著性方差分析，根据供试浓度的对数值和校正麻醉率的几率值，计算回归方程和麻醉中浓度（LC50）。计算公式：
麻醉率=麻醉黄粉虫数/供试黄粉虫数×100%
校正麻醉率=（处理麻醉率-对照麻醉率）/（1-对照麻醉率） ×100%
体质量增长率=（当前体质量-上一体质量）/上一体质量×100%
2 结果与分析
2.1 杠板归提取物对不同龄黄粉虫的麻醉活性
2.1.1 杠板归粗提物对黄粉虫麻醉最佳时间的测定 杠板归粗提物对3、6、8龄黄粉虫麻醉最佳时间的测定（图1、2、3）结果表明，不同龄的黄粉虫均以3 min为较好，且有剂量依赖效应。
2.1.2 杠板归不同层提取物麻醉活性的测定 由图4、5、6可见，在所供试的5个不同层提取物中，PE萃取物的麻醉效果对3、6、8龄黄粉虫的麻醉活性最好，其次为BuOH萃取物，这表明杠板归中所含的麻醉活性物质分布在极性较小的PE层和极性较大的BuOH层中。
2.1.3 对不同龄期黄粉虫的麻醉试验 由图7～11可知，试验中5个提取物的麻醉效果对3、6、8龄的黄粉虫，以3龄最为敏感，这表明试验中应注意选择低龄幼虫。
2.1.4 对时间、物质、龄期、浓度的互作情况分析 由表1知，由于因素间可能存在的交互作用，当单因素作用时，通过F值检验，表明麻醉效果受浓度的影响最大；当2因素交互作用时，浓度受物质的效应修饰最显著，表明在两因素交互作用中，选择不同物质处理也是影响试验效果的第2重要因素；当3因素交互作用时，可见龄期因素的作用可以修饰浓度与物质的交互作用；当4因素同时交互作用时，可知浓度、物质、龄期等3因素的交互作用被时间所修饰。结果表明，当不同浓度的不同物质麻醉不同龄期的黄粉虫时，麻醉效果所受因素的影响由大到小的顺序为浓度、物质、龄期、时间。其中，浓度为最主要因素，所以针对浓度做差异显著性检验（表2）。
由表2可知，4，2，1，0.5，0.25 mg·mL-1等5个不同浓度药液之间均达到极显著性差异，其中4 mg·mL-1的麻醉效果最明显，浓度在试验中起着决定性作用。
2.1.5 杠板归提取物对3、8龄黄粉虫的麻醉毒力分析 结果显示，杠板归提取物对3、8龄黄粉虫的麻醉效果最明显的均是PE萃取物，毒力回归方程分别为y=6.558 1+0.748 5x，y=6.173 3+0.953 9x；LC50分别为0.008 3，0.058 9 mg·mL-1，较其它物质的麻醉中浓度低（表3、4）；而BuOH萃取物对8龄黄粉虫的的麻醉效果仅次于PE萃取物，其毒力回归方程为y=5.328 6+0.953 9x，LC50为0.452 4 mg·mL-1，较其它物质的麻醉中浓度低（表4），推测活性成分主要分布在极性偏小的PE层所在极性范围内，也可能有少量分布在极性偏大的BuOH层所在极性范围内。
2.2 杠板归提取物对黄粉虫体质量的影响
通过对3、6、8龄黄粉虫体质量影响情况的显著性方差分析，针对每一个龄期，不同层的提取物在5种不同浓度处理下研究黄粉虫的平均体质量与浓度的关系，于饲喂后不同天数称量体质量。现以浓度为类，饲喂天数为组进行方差分析，可以得到0.5 mg·mL-1和1 mg·mL-1的浓度是抑制黄粉虫平均体质量增长的最显著浓度。选取低浓度0.5 mg·mL-1为例，针对最敏感的3龄黄粉虫进行下一步分析。
由表5可知，对黄粉虫平均体质量增长有明显抑制作用的物质是PE萃取物，其与对照达到了极显著水平。推测抑制黄粉虫体质量增长的活性成分在极性偏小的PE层所在极性范围内。所以，针对不同浓度的PE萃取物对3龄黄粉虫的平均体质量变化做差异显著性检验（表6）。
由图12和表6可知，不同浓度的供试药液对黄粉虫体质量的影响大体都呈增长的趋势，但可以看出随着时间的增加，低浓度抑制黄粉虫体质量的增长。其中0.5 mg·mL-1对黄粉虫体质量增长的抑制效果最显著，且与对照达到了极显著水平，体质量平均增长率为11.29%；而对照20%乙醇处理下的黄粉虫体质量平均增长率为14.19%，2 mg·mL-1处理下的黄粉虫体质量平均增长率最大，为15.81%，但与对照组没有达到显著水平。由此可知，低浓度抑制其体质量增长，高浓度反而促进其体质量增长。
3 结论与讨论
研究发现，杠板归提取物对供试昆虫主要表现出麻醉和抑制体质量增长的活性。试验表明，麻醉活性物质存在于不同层的提取物中，主要存在于PE层和BuOH层的萃取物中；3龄为最敏感龄期，实际应用中注意选择在最佳龄期时用药。推测其抗药性机理可能是由于代谢速率的差别和幼虫处于不同的生理时期而引起的，也可能是对于不同龄期的黄粉虫的活性成分可不一样，其机理有待进一步研究。PE萃取物对3龄黄粉虫的平均体重增长的抑制作用最明显，EtoAc萃取物的抑制作用次之，低浓度处理下抑制体质量增长最显著。生长抑制作用对于大多数昆虫来说，虽然没有达到直接控制害虫数量的目的，但不良的生长发育会直接影响到后期幼虫化蛹率和蛹的质量及大小。在试验过程中，经过杠板归提取物处理后的黄粉幼虫，伴随着生长缓慢，行动迟缓，蜕皮延期，虫体收缩变软的现象也验证了这一点。因此可对PE层、EtoAc层及BuOH层的萃取物进一步分离、鉴定。
本试验推测的活性物质分布在PE层和BuOH层中，根据极性大小，可以推测活性化合物种类可能是极性偏小的黄酮类化合物、萜类化合物和极性偏大的黄酮苷类、酚羧酸类化合物。目前已知卫矛科杀虫植物苦皮藤（Celastrus angulatus Max.）对10多种重要的农林害虫均有良好的防治效果，其中对菜青虫（Pieris rapae）、粘虫（Mythimna separate）、槐尺蠖 （Semiothisa cinerearia） 等主要表现为麻醉作用[14]，对蝗虫（Locusta migratoria）、芫菁叶蜂（Athalia rosae）、小菜蛾（Plutella xylostella）有强烈的拒食作用[15]；已从苦皮藤中分离鉴定出了具有麻醉活性化合物苦皮藤素Ⅳ[15]和具有拒食活性的化合物苦皮藤素Ⅰ[16-17]。目前对杠板归的研究主要集中在黄酮类及蒽醌类的化学成分及其药理活性上，是否有其他化学成分及活性物质尚不明确，还需在生物活性指导下进行系统分离研究。以活性为指导对杠板归的有效活性成分、结构、构效关系以及防治病虫害的作用机制进行深入系统的研究，可为进一步开发我国植物源农药提供理论基础。
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