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[摘要] 目的 探讨不同类型淋巴瘤组织中Notch1、Notch2、 Notch3跨膜受体蛋白的表达规律。 方法 通过免疫组织化学SP技术，观察59例淋巴瘤组织和21例淋巴结反应性增生组织中Notch的表达水平。 结果 Notch1在T细胞淋巴瘤组和NK/T细胞淋巴瘤组表达的阳性率显著高于B细胞淋巴瘤组及对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。B细胞淋巴瘤组和NK/T细胞淋巴瘤组Notch2表达的阳性率明显高于T细胞淋巴瘤组和对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。NK/T细胞淋巴瘤组Notch3表达的阳性率明显高于其他三组，差异有统计学意义（P<0.01）。结论 Notch信号通路的异常活化与淋巴瘤的发生、发展密切相关。其中NK/T细胞淋巴瘤的发生、发展可能与Notch1、Notch2、Notch3的高表达有关；Notch1的高表达可能在T细胞淋巴瘤的发生、发展中起到重要作用；B细胞淋巴瘤的发生、发展与Notch2的高表达相关。
[关键词] Notch；淋巴瘤
[中图分类号] R733.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）12-0005-04
The expression and its significance of Notch1-3 protein in lymphoma
XING Hongyan1，2 TENG Qingliang3
1.Qingdao University Medical College，Qingdao 266000，China； 2.Taishan Nursing Occupation College，Tai`an 271000，China； 3.Department of Hematology，the Central Hospital of Tai"an City in Shandong Province，Tai"an 271000，China
[Abstract] Objective To explore the expression and its significance of Notch1、Notch2、 Notch3 transmembrane receptor protein in different types of lymphoma tissues. Methods By employing immunohistochenistry SP staining，the expressions of Notch in 59 lymphomas were detected， and 21 cases of lymph-node reactive hyperplasia served as control group. Results The expression of Notch1 was significantly higher in T-cell lymphoma and NK/T-cell lymphoma than that in the B-cell lymphoma and the control group， the difference was statistically significant（P<0.01）. The expression of Notch2 was obviously higher in B-cell lymphoma and NK/T-cell lymphoma than that in the T-cell lymphoma and the control group，the difference was statistically significant（P<0.01）. The expression of Notch3 in NK/T-cell lymphoma group was significantly higher than that in the other three groups， the difference was statistically significant（P<0.01）. Conclusion Abnormal activation of Notch signaling pathway is closely related to the occurrence and development of lymphoma. The occurrence and development of NK/T-cell lymphoma is probably associated with the high expression of Notch1， Notch2 and Notch3； The occurrence and development of T- cell lymphoma is probably related to the high expression of Notch1； The occurrence and development of B-cell lymphoma is probably associated with the high expression of Notch2.
[Key words] Notch；Lymphoma
非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）是一组异质性很强的血液系统恶性肿瘤。目前，在世界范围内淋巴瘤已成为发病率增长最快的血液系统恶性肿瘤，在血液系统恶性肿瘤的排名中仅次于白血病，严重威胁患者生命健康。虽然治疗手段，如化疗、放疗相结合、生物治疗、靶向治疗、骨髓或造血干细胞移植等的综合运用不断提高，在一定程度上提高了治愈率及生存率，但仍有很大部分恶性淋巴瘤复发，其因肿瘤导致的死亡率排名第十位[1]。
因此深入探讨淋巴瘤的发病机制，寻找新的治疗靶点已成为研究热点。很多研究发现Notch信号通路不仅在多器官及细胞的正常发育中发挥重要作用，其异常表达亦与一系列肿瘤的发生、发展密切相关，本研究主要检测Notch1～3受体蛋白在淋巴瘤组织中的表达，进而发现规律，探讨其在淋巴瘤发病中的作用。
1 材料与方法
1.1 标本及来源
收集泰安市中心医院2008年8月～2014年8月的新发非霍奇金淋巴瘤的病理组织标本共59例，所有组织经泰安市中心医院病理科专家划分组织学类型，提出病理诊断。其中B细胞淋巴瘤39例（弥漫大B细胞淋巴瘤23例，滤泡性淋巴瘤5例，小淋巴细胞淋巴瘤5例，黏膜相关淋巴组织结外边缘区B细胞淋巴瘤6例），T细胞淋巴瘤12例（包括血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤2例，间变性大细胞淋巴瘤3例，外周T细胞淋巴瘤7例），NK/T细胞淋巴瘤（鼻型）8例。59例患者中男33例，女26例；中位年龄54.35岁（最小6岁，最大82岁）。同时收集21例淋巴结反应性增生的组织标本作为对照组。所有病例均为初发，未经任何抗肿瘤治疗及免疫治疗等。
1.2主要试剂
跨膜受体蛋白Notch1抗体、跨膜受体蛋白Notch2抗体、跨膜受体蛋白Notch3抗体均购自上海安研商贸有限公司，SP免疫组化检测试剂盒及浓缩型DAB染色试剂盒均购自福州迈新生物公司。
1.3方法
所有组织标本经4%甲醛溶液固定送病理科进行脱水、石蜡包埋、切片，然后采用免疫组织化学SP染色法进行染色。首先，切片置于60℃烘箱中烘烤过夜后经二甲苯脱蜡和梯度酒精（浓度递减）水化，经PBS冲洗后将切片再浸入枸橼酸缓冲液进行高温抗原修复，PBS冲洗；将3%H2O2溶液滴到切片上，室温避光孵育20 min，用以灭活内源性过氧化物酶；向组织切片滴加正常非免疫动物血清进行抗原封闭；滴加一抗（100倍稀释），4℃过夜，复温后滴加二抗、三抗，再滴加DAB显色液；苏木精复染后，经1%盐酸酒精分化，梯度酒精（浓度递增）脱水，二甲苯透明，干燥后中性树胶封片，显微镜下观察结果。用已知阳性标本作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。
1.4 结果判定
Notch1～3受体蛋白细胞染色判断标准参考文献[2]，染色随机取5个高倍（×400）视野，观察染色阳性细胞百分数及染色程度。染色细胞数占细胞总数的百分数：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，≥51%为3分。染色强度：未着色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，深棕黄色及棕褐色为3分。染色细胞占细胞总数的百分数乘以染色强度，通过得分判断结果，0分和1分视为阴性，2分以上为阳性。
1.5统计学分析
采用SPSS19.0统计学软件进行数据处理。4×2表整体进行Fisher精确检验，P<0.05为差异有统计学意义。不同病理类型间Notch1、Notch2、Notch3蛋白阳性率的两两比较采用χ2检验和Fisher确切概率法，用Bonferroni法对检验水准进行校正，校正值为0.008。
2 结果
2.1 Notch受体蛋白在不同类型淋巴瘤及淋巴结反应性增生组织中的表达水平
见表1。Notch受体蛋白免疫组化染色部分主要集中在细胞膜，部分散在分布于胞浆、胞核中，阳性细胞散在分布于视野中。
表1 Notch受体蛋白在病理组织中的表达水平
注：*表示差异有统计学意义
2.2 Notch受体蛋白阳性表达率与淋巴瘤病理类型的相关性分析
Notch1受体蛋白阳性表达率与淋巴瘤病理类型的相关性分析，见表2。Notch1蛋白在T细胞淋巴瘤组、NK/T细胞淋巴瘤组、B细胞淋巴瘤组及对照组的阳性率，分别为83.33%（10/12）、75.00%（6/8）、17.95%（7/39）和9.52%（2/21），T细胞淋巴瘤组、NK/T细胞淋巴瘤组Notch1受体蛋白的表达阳性率明显高于B细胞淋巴瘤组和对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。T细胞淋巴瘤和NK/T细胞淋巴瘤Notch1蛋白表达的阳性率比较差异无统计学意义（P>0.05）；B细胞淋巴瘤组和对照组的Notch1蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。
表2 Notch1蛋白在不同病理类型中阳性率的两两比较
注：#表示连续性校正χ2值，*表示差异有统计学意义
2.3 Notch2蛋白在不同病理类型中阳性率的两两比较
Notch2受体蛋白阳性表达率与淋巴瘤病理类型的相关性分析，见表3。Notch2蛋白在T细胞淋巴瘤组、NK/T细胞淋巴瘤组、B细胞淋巴瘤组及对照组的阳性率分别为8.33%（1/12）、62.50%（5/8）、58.97%（23/39）和4.76%（1/21），B细胞淋巴瘤组和NK/T细胞淋巴瘤组Notch2受体蛋白阳性率明显高于T细胞淋巴瘤组和对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。NK/T细胞淋巴瘤组与B细胞淋巴瘤组Notch2蛋白表达的阳性率比较差异无统计学意义（P>0.05）。T细胞淋巴瘤组与对照组的Notch2蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。
表3 Notch2蛋白在不同病理类型中阳性率的两两比较
注：#表示连续性校正χ2值，*表示差异有统计学意义
2.4 Notch3蛋白在不同病理类型中阳性率的两两比较
Notch3受体蛋白阳性表达率与淋巴瘤病理类型的相关性分析，见表4。Notch3蛋白在T细胞淋巴瘤组、NK/T细胞淋巴瘤组、B细胞淋巴瘤组和对照组的阳性率分别为16.67%（2/12）、62.50%（5/8）、5.13%（2/39）和4.76%（1/21），NK/T细胞淋巴瘤Notch3蛋白表达的阳性率明显高于T细胞淋巴瘤组、B细胞淋巴瘤组和对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。T细胞淋巴瘤组、B细胞淋巴瘤组和对照组的Notch3蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。
表4 Notch3蛋白在不同病理类型中阳性率的两两比较
注：#表示连续性校正χ2值，*表示差异有统计学意义
3 讨论
Notch信号通路由Notch受体、Notch配体、细胞内效应器分子（CSL-DNA结合蛋白）、下游靶基因及其他效应物等构成。Notch受体是一类结构高度保守的Ⅰ型单链跨膜蛋白，人的Notch受体家族包括Notch1～4。Notch受体包括胞外区、跨膜区和胞内区三部分。Notch信号通路被发现已有近百年，大量研究提示其不但涉及所有细胞的增殖、分化、凋亡等活动，而且Notch信号通路的异常活化在肿瘤发生发展过程中起着重要作用[3，4] 。本研究旨在观察Notch1、2、3受体蛋白在不同类型淋巴瘤组织中的表达情况，了解其与淋巴瘤发生的相关性，为进一步研究提供依据。
Notch1在T淋巴细胞肿瘤的研究中发现，约50%的急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）病例存在Notch1基因点突变或染色体易位，引起Notch1信号的异常活化，是导致T-ALL的原因之一[5，6]。这与本研究结果相似，Notch1在T细胞淋巴瘤和NK/T细胞淋巴瘤中的表达明显高于B细胞淋巴瘤和对照组，提示Notch1在不同类型淋巴瘤发生中的作用可能不同，T细胞淋巴瘤和NK/T细胞淋巴瘤的发生可能与Notch1信号通路的异常活化有关。
Notch信号通路在B细胞淋巴瘤发病中所发挥的作用仍存在争议，出现了致瘤和抑瘤两种相反报道。本研究结果显示Notch1、3受体蛋白在B细胞淋巴瘤中的表达与对照组没有明显差异，但Notch2受体蛋白的表达明显高于T细胞淋巴瘤组和对照组，提示B细胞淋巴瘤的发生可能与Notch2受体蛋白表达升高有关。以往研究报道，Burkitt淋巴瘤Raji细胞、套细胞淋巴瘤Maver和Z138细胞可表达Notch1、Notch2，Raji细胞同时表达Notch下游靶基因Hes1[7]；有研究发现约8%弥漫大B细胞淋巴瘤和5%边缘区淋巴瘤组织标本中可检测到Notch2的突变[8，9]，提示Notch2突变可能参与了 B细胞淋巴瘤的发生、发展。相反，Zweidler-McKay PA[10]等研究发现，Notch2 的持续活化可抑制B细胞恶性肿瘤的生长，激活 Notch/Hes1信号可能成为治疗B细胞恶性肿瘤的一种新方法。但相关研究数量有限，还需继续深入研究，累计资料以明确Notch信号通路对B细胞淋巴瘤的作用。
Notch信号通路在NK/T细胞淋巴瘤发病中的作用研究较少，本研究显示，Notch1、2、3在NK/T细胞淋巴瘤中的表达均明显高于对照组，提示NK/T细胞淋巴瘤的发生可能与Notch信号通路的异常活化有关，与胡彦伟[11]等的研究结果有相似之处。但由于总体样本量小，可能存在抽样误差，还需进一步深入研究。
综上所述，本实验研究了Notch1～3受体蛋白在不同类型淋巴瘤组织中的表达情况，提示不同Notch受体蛋白的高表达可能与淋巴瘤的发生、发展密切相关，但在不同类型淋巴瘤发病中所起的作用可能不尽相同。因此，活化或阻断Notch信号通路可能成为治疗不同类型淋巴瘤的新方法。如王艳芳等[7]研究发现γ-分泌酶抑制剂DAPT通过抑制Notch受体信号通路，对Jurkat细胞和Raji细胞的增殖有明显的抑制及诱导凋亡作用，可以将细胞周期阻滞在G1期，并抑制Notch 通路的下游靶基因Hes1的表达，但对Maver和Z138细胞的作用较弱。Maria 等[12]使用DAPT作用于外周T 细胞淋巴瘤细胞，发现可降低Notch1 表达量并可引起肿瘤细胞的凋亡。另外，shRNA 靶向沉默Notch1 基因表达可以诱导套细胞淋巴瘤Jeko-1 细胞的凋亡[13]。上述研究均为探讨淋巴瘤的发病机制及靶向治疗措施提供了依据和参考，并为进一步的研究指明了方向。
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（收稿日期：2015-02-14）