打开文本图片集
[摘要]动物药主要含蛋白质，蛋白质是具有四级结构的有机大分子，具有热变性的属性，在高温条件下持续作用时，蛋白易变性而致其生物活性丧失、某些理化性质和生物化学性质改变。水蛭是经典的破血逐瘀类动物药。炮制入药历史悠久，其传统的炮制方法，无论是《中国药典》收载的滑石粉烫炒法还是北京地区的特色炮制工艺酒炙法，基本都需要高温处理，其炮制目的多局限于当时技术条件。该文从水蛭现有炮制工艺及其特点出发，对高温炮制前后水蛭的主要活性成分与药理活性的变化进行总结，分析结果表明高温炮制会使水蛭中的蛋白质变性；活性多肽水蛭素会被部分或完全破坏；炮制过程会使水蛭中铅（Pb）、汞（Hg）、镉（Cd）等有毒无机元素含量下降；加热也会促使水蛭中某些物质转化为具有降压、平喘、镇痛作用的次黄嘌呤，进而实现减毒和缓和药性的目的。高温对水蛭药理活性的影响主要表现在抗凝活性、抗血栓活性等方面。该文在了解动物药水蛭炮制研究现状的同时，对水蛭高温炮制科学合理性未来的研究手段和研究方向提出思考。
[关键词]动物药；水蛭；高温炮制；科学合理性
[Abstract]Animal medicines mainly contain protein which was organic molecule with quaternary structure and had the property of thermal denaturation When suffering from heat for a consistent time， the native conformation of protein would be destroyed After denaturation the biological activity of protein will lose and some physicochemical and biochemical properties will be changed Leech was a classical animal medicine in the views of traditional Chinese medicine （TCM） which had the functions of breaking stagnant and eliminating blood stasis In the usage history， it was processed for a long time No matter stirfrying leech with talc powder embodied in Chinese Pharmacopoeia or stirbaking with wine as a distinctive method in Beijing district， the process procedure was basically performed under high temperature The purposes and intentions of process are mostly limited to technology conditions at specific historical period In this article， based on existing processing procedure and its character of Leech， the changes of active components and pharmacological activities before and after processing under high temperature were summarized The results demonstrate that the protein of leech would be denaturated； some active peptide such as hirudin were partly or totally destroyed； some toxic mineral elements， such as Pb， Hg， Cd， were decreased； at the same time， heating can promote some chemical components transforming into hypoxanthine which had the function of antihypertensive， antiasthmatic and antalgic Consequently， after processed under high temperature， the purpose of decreasing toxicity and alleviating the strong property was achieved Pharmacological changes of leech processed under high temperature were mainly manifested in the anticoagulant and antithrombotic activity， etc Based on current processing research status about animal medicine leech， future research methods and directions on scientific connotation of leech processed under high temperature were put forward in this article
[Key words]animal medicine； Chinese medicine leech； processing under high temperature； scientific rationality
水蛭是经典的破血逐瘀类动物药。炮制入药，始于东汉张仲景的《伤寒论》，其传统的炮制方法基本都需要高温处理。动物药的主要成分为蛋白质，蛋白质具有热变性的属性，一般来说，蛋白质稳定的构象由氢键和范德华力共同维系，温度升高到某一限定点就可以破坏其氢键等次级键，使分子处于变性状态，从而导致生物活性丧失、某些理化性质和生物化学性质改变。随着科学技术的发展，高温炮制动物药水蛭的科学合理性遭到了质疑。水蛭现存传统炮制工艺是否合理？其高温炮制过程的科学实质何在？本文从水蛭现有炮制工艺及其特点出发，对高温炮制前后水蛭的主要活性成分与药理活性的变化进行总结，了解动物药水蛭炮制研究现状，并对动物药高温炮制科学合理性未来研究的方向提出思考。
1水蛭现有炮制工艺与特点
水蛭现有酒炙、滑石粉烫炒等诸多炮制方法[1]，滑石粉烫炒是药典收载的临床应用最广的水蛭炮制方法，酒炙法为北京特色炮制工艺，在北京等地区习用，见表1。2种方法的炮制目的均为矫臭减毒，使药材质地酥脆，易于粉碎；2种方法均需要热处理，且烫炒温度高于酒炙法的温度。
2高温对水蛭中主要活性成分的影响
2.1蛋白质及多肽类成分蛋白质是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质。Yanes 等[2]的研究显示：水蛭中含有多种多肽和蛋白质，蛋白质在炮制过程中，由于温度升高，蛋白质吸收的能量超过了分子间作用力，导致蛋白质空间构象被破坏，维持和稳定空间构象的二硫键、氢键断裂，整个蛋白质的螺旋链被破坏打开，肽链转变成无规卷曲状态，无序结构增加，从而使蛋白质变性[3]。尽管蛋白质的空间结构发生了改变，但蛋白质的一级结构并未受到影响。王厚伟[4] 采用SDSPAGE检测发现，在高温炮制工艺条件下水蛭的部分水溶性蛋白常被自身释放的蛋白酶降解为小分子肽或游离的氨基酸，由此推测水蛭提取物中所含有的游离氨基酸可能是水蛭产生抗凝血作用的主要有效成分。
2.2水蛭素2010年版《中国药典》水蛭项下收载的3个品种中均含有水蛭素[5] 。迄今对水蛭素的研究也最为透彻，20世纪50年代Markwardt从吸血医蛭唾液腺中成功分离出一种物质，并命名为水蛭素。水蛭素是一种小分子单链多肽，其N端含有3个二硫键，是核心区域，具疏水性，是凝血酶的活性位点。尾部C端含有较多的酸性氨基酸，为阻止凝血酶与纤维蛋白原的识别位点，产生抗凝作用。中部是水蛭素与凝血酶结合的催化位点[68]。水蛭素是目前已知最强的凝血酶特异性抑制剂[9]。
有研究表明[1012] ：水蛭素主要存在于水蛭新鲜水蛭的唾液中，水蛭素的热稳定性较差，在碱性条件下加热则失去活性，在80 ℃，pH 13的条件下处理15 min则其活性完全丧失。戴作波[13]和李艳玲等[14]的研究表明水蛭素的含量在生品中最高，经过高温炮制后含量下降，炮制品中的水蛭素部分或完全被破坏，而经过煎煮人口服后，在水解和胃蛋白酶作用下，会损失殆尽。水蛭“鲜品生品炮制品”的制备过程即是水蛭素损失的过程，但是毋庸置疑的是，水蛭生品及炮制品仍表现出很强的药理活性，因此，水蛭素是否为水蛭的主要药效成分值得商榷。
2.3氨基酸刘轶华等[15]对水蛭水解氨基酸的研究结果显示，水蛭中含有17种氨基酸，含量约占水蛭总重的49%以上，其中7种是必需氨基酸，包括色氨酸、赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸。
樊小容[16]用氨基酸自动分析仪对水蛭及其炮制品进行氨基酸定量分析， 结果氨基酸总量水蛭生品为 2785%， 烫水蛭为 5489%， 烫水蛭的氨基酸含量明显高于水蛭生品。而刘丽芳等[17]采用柱前衍生HPLC测定水蛭提取物，发现炮制品氨基酸的含量较生品的氨基酸含量有所降低。由于氨基酸测定方法不同，这两种截然相反的结果提示氨基酸的含量测定还有待进一步研究。
2.4无机元素水蛭中含有14种微量元素。其中钙（Ca）、镁（Mg）是人体所必需的宏量元素；锌（Zn）、锰（Mn）、铜（Cu）、铁（Fe）元素是人体内必需的微量元素；铅（Pb）、汞（Hg）、镉（Cd）等为有毒元素[18]。史红专等[19]通过对生晒品、滑石粉制品与酒制品的无机元素对比可知，一方面，养殖的水蛭炮制品的Ca，Mg含量较丰富，皆高于生晒品。而Zn，Mn，Cu，Fe含量由高到低的顺序为生水蛭>酒水蛭>烫水蛭。另一方面，Pb，Cd，Hg含量均低于生晒品含量。这表示水蛭经炮制后可使其毒性降低，减少水蛭的毒性反应，提高临床用药安全。
2.5次黄嘌呤次黄嘌呤为最常见的水蛭含量测定的标准物质，其具有降血压、平喘、镇痛等[20]作用。张永太[21] 以HPLC测定水蛭中次黄嘌呤的含量，发现制水蛭的次黄嘌呤含量明显高于生水蛭的次黄嘌呤含量。分析原因可能是加热促使某些物质转化为次黄嘌呤，从而提高了炮制品中该成分的含量，以达到减毒及缓和药性的目的。
2.6其他成分除以上几种化学成分外，水蛭中尚有许多其他抗凝血活性组分。
朱正光等[22]的实验结果推测宽体金线蛭水煎液的醇溶部分存在与水蛭素类似的却具有热稳定性的抗凝血活性组分，由于煎煮和乙醇提取过程会导致蛋白质变性而失去活性，故这种抗凝活性组分绝非蛋白酶类物质。但大多数物质在水和乙醇中都有较好的溶解性，要判断抗凝活性组分的具体成分还需要进一步的分离纯化。
钟山等[23]在宽体金线蛭的晒干品中进行分离提纯，得到3个抗凝血活性多肽，对相对分子质量分别为7 100，5 531，8 608，把第三种抗凝多肽命名为蚂蝗多肽。这是一种与水蛭素具有很大同源相近性的糖基化多肽。然而不同于水蛭素的是，蚂蝗多肽是从生晒品中提取出来的，说明它并不只存在于新鲜活体中，而且从它经过干燥和长期的储存后仍保持良好活性，可以看出其性质相对水蛭素稳定。
3高温对水蛭主要药理活性的影响
3.1抗凝活性水蛭的主要作用为抗凝作用。水蛭的抗凝原理[24]是活性组分作用于凝血过程，抑制凝血酶及纤维蛋白溶酶，从而阻断凝血反应的进行，达到抗凝的目的。张永太[25]则运用凝血酶滴定法研究水蛭炮制前后药理作用的差异。实验结果表明，生水蛭每1 g含抗凝血酶活性单位虽大于制水蛭的，但2种药材每克含抗凝血酶活性单位均大于160 U，符合2010年版《中国药典》中相关要求。而李冰宁等[26] 则发现生品经过100 ℃处理后，抗凝效价为 275 U，比水蛭鲜品降低15 U。而炮制品抗凝效价仅为15 U，这是高温导致与抗凝药效相关的一些活性物质变性失效，其中因为炮制品处理温度最高，所以药效损失程度相对也越大。然而不论其抗凝效价大于16 U还是等于15 U ，都可以说明高温会使水蛭的活性降低，但并不会使其抗凝活性全部丧失。吕文海等[27]以水蛭给小鼠灌胃之后取血，测定小鼠的凝血时间。经对比可知酒制水蛭超微组小鼠的凝血时间远远长于生水蛭超微组的凝血时间，即经酒制增强了水蛭的抗凝活性。刘曙晨[28]以凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）和活化部分凝血活酶时间（APTT）为指标，发现烫水蛭的甲醇提取液可使APTT，PT，TT显著延长，而且甲醇提取液皆随药物浓度的增加而抗凝血作用增强。其研究结果还表明生水蛭和烫水蛭的甲醇提取液组间比较无显著性差异，即生水蛭的甲醇提取物和经滑石粉高温烫炒过的水蛭的甲醇提取物抗凝血效果相当。因此高温虽会使水蛭的抗凝活性下降，但其依然具有抗凝活性。
3.2抗血栓活性凝血酶对血栓形成的主要作用是[29]：使纤维蛋白凝固；激活血小板产生血小板聚集；产生更多的凝血酶。Alibeik 等[30]和袁继伟等[31]的研究表明水蛭还具有直接溶解血栓的作用，因为它既可以与血浆中游离的凝血酶结合，又可以中和与纤维蛋白结合的凝血酶，从而防止血栓的形成和延伸。
史小莲[32]研究发现，水蛭经高温加热煎煮后的浓缩物仍可减轻大鼠静脉血栓的湿重和干重，抑制静脉血栓形成，并延长大鼠颈总动脉血栓形成时间，抑制动脉血栓形成，减轻大鼠血小板血栓的湿重，抑制血小板血栓形成。张永太的抗栓试验方法学研究结果显示，生水蛭的水煎液与烫制水蛭的水煎液的出血时间，没有显著性差异。同样的，生水蛭的甲醇提取液与烫制水蛭的甲醇提取液的出血时间亦接近。这说明高温炮制过程并没有对水蛭的抗血栓活性产生显著性影响。
3.3其他作用武继彪等[33]分别以水蛭生品、烫品、酒润麸炒品给高脂血症大鼠灌胃，10 d后测定结果，三者有明显纠正血浆脂蛋白紊乱的作用。其中以酒制品调脂作用最强，烫品和生品次之。
水蛭还具有抗炎、抗肿瘤、抗癌等作用，对心脑血管疾病也有一定的疗效。高温炮制前后对这些药理作用影响的研究报道较少。
4动物药水蛭高温炮制科学合理性的分析与展望
动物药因成分的复杂性及研究的高成本性，质量控制相对滞后。动物药水蛭临床以炮制品入药，水蛭经炮制后入药似受宋代误传“水蛭不制入腹生子为害”之说的影响。应用已有2 000余年的历史，其炮制目的多局限于当时技术条件。从上述高温炮制前后水蛭中的主要活性成分变化及高温对水蛭药理活性的影响的对比分析可知：水蛭高温炮制后化学成分的变化能有一定的增效减毒和缓和药性的作用，但缺乏突破性研究成果。
动物药主要含蛋白质，从蛋白质化学的角度阐释，蛋白质是具有四级结构的有机大分子，在受到热、乙醇等溶剂作用时，易导致天然构象的破坏，从而使蛋白质的生物活性丧失。高温炮制动物药，药物中蛋白质热变性所导致的药效改变难以得到有效的控制。另一方面，现代研究表明：异体蛋白一般易导致机体的过敏和排斥反应，高温处理可以降低其致敏性。高温处理动物类中药的炮制方法其炮制的真实内涵何在？炮制辅料（乙醇等）与药物是否存在相互作用？现存的加热炮制工艺是否合理？ 炮制减毒的同时能否兼顾其药效，目前尚缺乏深入的研究。近年来，蛋白质组学（proteomics）[34]一直是研究热点，利用蛋白质组核心技术，即高通量的双向凝胶电泳（2DE）和高效的生物质谱技术，实现对包含多达几千种蛋白混合物的分离、检测和分析。目前Baskova等[3536]在分析不同季节医用水蛭唾液腺中蛋白总成分差异性的实验中，已初步构建水蛭蛋白成分群2DE分离纯化的方法。水蛭生品及其炮制品一定程度上可看作是蛋白质、活性多肽的复杂混合体系，高温炮制工艺过程，辅料与药物之间存在怎样的相互作用？炮制过程蛋白质的组成、构象、空间结构的动态改变与炮制的温度和程度之间存在怎样的相关性？鉴于蛋白质组学技术在复杂蛋白质群混合体系质量控制中的独特优势，利用蛋白质化学技术，借鉴大数据时代的信息化手段，加强动物药水蛭高温炮制过程的质量控制，能使整个工艺环节更加标准化和客观化，在水蛭饮片质量控制方面形成自主知识产权，从而提升动物药的质量控制体系。
[参考文献]
[1]陈干先 不同炮制工艺对水蛭药效成分含量的影响[J] 中国医药导报， 2008， 5（5）：31
[2]Yanes O， Villanueva J， Querol E， et al Functional screening of serine protease inhibitors in the medical leech Hirudo medicinalis monitored by intensity fading MALDITOF MS[J] Mol Cell Proteomics， 2005， 4（10）：1602
[3]李冰宁， 武彦文， 欧阳杰， 等 应用红外光谱技术研究中药水蛭炮制过程[J] 光谱学与光谱分析， 2011， 4（7）：979
[4]王厚伟 低温炮制工艺对水蛭水溶性蛋白组成及纤溶活性的影响[J] 中药材， 2007，30 （3）：272
[5]张卫， 张瑞贤， 李健，等 中药水蛭品种考证及资源可持续利用发展探讨[J] 中国中药杂志， 2013， 38（6）：914
[6]韩国柱 水蛭素的生理处置及药动学研究现状[J] 中草药， 2003， 34 （8）：103
[7]Liu Yu， Wan Bo， Yan Tianhua， et al Effect of recombinant hirudin variant Ⅲ emulsive microparticles on thrombosis and the study on its oral absorption mechanism[J] Chin J Nat Med， 2010， 8（6）： 474
[8]赵恒利， 崔晞， 郭瑞臣， 等 水蛭素基础及临床研究发展状况[J] 中国药学杂志， 2006， 41（5）：321
[9]王敏， 崔连群， 张承俊， 等 凝血酶诱导血管内皮细胞生长因子的表达及水蛭素的抑制作用[J] 中国新药杂志， 2004， 13（3）：226
[10]Greinacher N， Lubenow N Recombinant hirudin in clinical practice： focus on lepirudin[J] Circulation， 2001， 103（10）：1479
[11]陈华友， 黄静， 蒋芝君， 等 抗凝良药水蛭素的研究进展[J]. 生物学通报， 2003， 38（3）：3
[12]刘欣， 张文清， 夏玮， 等 提取水蛭有效成分初探[J] 中成药， 2002，24（11）：72
[13]戴作波 水蛭及其炮制品中水蛭素的测定[J] 求医问药， 2012， 10（12）：343
[14]李艳玲， 赵丽 水蛭及其炮制品的体内抗凝血活性研究[J] 安徽农业科学， 2009， 37（34）：16894
[15]刘轶华， 穆晓燕， 陈保红 水蛭活血成分研究及临床应用[J] 中国现代药物应用， 2013， 7（11）：192
[16]樊小容 炮制对水蛭氨基酸成分的影响[J] 海峡药学， 2000， 12（4）：44
[17]刘丽芳， 金蓉鸾， 徐国钧， 等 中药水蛭经炮制后的成分变化研究[J] 中成药， 2001， 23（12）：24
[18]荆文光，符江，刘玉梅，等. 水蛭的化学成分[J]. 中国实验方剂学杂志，2014，20（19）：120.
[19]史红专， 郭巧生， 刘飞， 等 野生和人工养殖蚂蟥不同炮制品内在质量的比较研究[J] 中国中药杂志， 2007， 32（24）：2657
[20]刘晓帆， 杨瑶珺， 吴丽洁， 等 中药水蛭生药学与化学成分的研究进展与展望[J] 环球中医药， 2012， 5（8）：637
[21]张永太 水蛭饮片次黄嘌呤含量测定[J] 中成药， 2008， 30（8）：1175
[22]朱正光， 吴曙光， 孙燕荣 水蛭水煎液抗栓作用机制的体外实验研究[J] 中国生化药物杂志， 2001， 22（5）：229
[23]钟山， 杨得坡， 崔征 水蛭抗凝血活性成分的研究[J] 中国中药杂志， 2008， 33（23）：2781
[24]邓妙丽， 李宝红， 程怡， 等 水蛭的研究概况[J] 海峡药学， 2012，24（3）：5
[25]张永太 水蛭炮制前后质量比较[J] 中国中药杂志， 2008， 33（7）：766
[26]李冰宁， 武彦文， 刘玲玲， 等 中药水蛭炮制前后水溶性蛋白组成及药效的研究[C] 齐齐哈尔：2010 First International Conference on Cellular， Molecular Biology， Biophysics and Bioengineering，2010
[27]吕文海， 邱福军， 王作明 炮制与超微粉碎对水蛭药效影响的初步实验研究[J] 中国中药杂志， 2001， 26（4）：25
[28]刘曙晨 水蛭抗凝血作用及化学成份的研究[D] 北京： 中国人民解放军军事医学科学院， 2006
[29]吕莉， 宋慧君， 韩国柱， 等 重组水蛭素药理学研究进展[J]. 血栓与止血学， 2003， 9（1）：31
[30]Alibeik S，Zhu S，Brash J L.Surface modification with PEG and hirudin for protein resistance and thrombin neutralization in blood contact[J].Colloids Surf B Biointerfaces， 2010， 81（2）： 389
[31]袁继伟， 焦跃军， 李晶尧， 等 中药水蛭的药理药效研究[J]. 中国医疗前沿， 2009， 4（18 ）：18
[32]史小莲， 刘俊田， 李西宽， 等 水蛭免加热提取物抗凝血及抗血栓作用[J] 中药新药与临床药理， 2004， 15（2）：95
[33]武继彪， 刘红兵， 吕文海， 等 3种水蛭炮制品调脂作用比较[J] 中国中药杂志， 1994， 19（6）：343
[34]Wright P C， Noirel J， Ow S Y， et al A review of current proteomics technologies with a survey on their widespread use in reproductive biology investigations[J] Theriogenology 2012 ，77（4）：738
[35]Baskova I P， Zavalova L L， Kostrjukova E S， et al proteomic analysis methods for characterization of proteins from the salivary gland secretions of the medicinal leech during different seasons[J] Biochemistry， 2007， 72（2）：219
[36]Baskova I P， Zavalova L L， Basanova A V， et al Protein profiling of the medicinal leech salivary gland secretion by proteomic analytical methods[J] Biochemistry，2004， 69（7）：770
[责任编辑孔晶晶]