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[摘要]根据不同规格何首乌的煎煮成分对肝细胞毒性的差异，探讨何首乌饮片规格对其安全性的影响。该研究通过建立何首乌8种主要化学成分的含量测定方法，测定不同规格何首乌水煎液样品中各化学成分的含量，并以其对正常人L02肝细胞的抑制率作为肝毒性的评价指标，采用多元相关分析，试图找出与毒性相关的化合物。结果显示不同规格何首乌饮片成分溶出差异较大，何首乌打粉饮片的肝细胞毒性显著强于何首乌块状饮片；通过多元相关分析发现了3个与何首乌肝毒性密切相关的成分。结果揭示了饮片规格与何首乌肝细胞毒性的关系，其中粉状规格饮片毒性相对较大，有一定的肝损伤风险，应予以高度重视。
[关键词]何首乌；饮片规格；肝毒性；多元相关分析；顺式二苯乙烯苷；大黄素
何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb的干燥块根，始载于《开宝本草》，是一味著名的传统补益类中药。近年来，随着公众健康意识的增强，何首乌亦被广泛用于补肝肾、乌发的中药制剂、保健食品、洗护发用品，以及大众日常餐饮、食疗保健等，但是涉及何首乌肝损伤的文献报道也逐渐增多[1]。我国以及韩国、日本、新加坡、英国等文献报道有关何首乌肝损伤病例180余例[210]。国家不良反应中心收到的有关何首乌及其制剂的不良反应报告（以肝损伤为主）近万份。2006年英国、澳大利亚和加拿大药监部门先后发布了何首乌肝损伤警告信息，2006，2013，2014年我国药监部门也多次发布了含首乌制剂肝损伤警示和监管通告。可见何首乌肝毒性的问题已引起国内外高度关注。针对何首乌不良反应问题，诸多学者采用常规毒理学方法进行研究[1119]，虽然因动物的种属不同、药材的来源不同、实验设计方案的不同而有所差异，但是结果表明何首乌在临床剂量下应用是无毒的，因此对于何首乌肝毒性问题一直存在争议。通过基于整合证据链对何首乌肝毒性进行客观辨识[2021]，发现何首乌致肝损伤的影响因素主要可以概括为两方面：一是药材本身原因，如炮制不规范、存在配伍禁忌、药材质量问题等[22]；二是人的原因，如存在特异质人群（易感人群）[23]，没有按照中医辨证用药，患者自行超大剂量长期服用等。进一步对302医院的病人随访调查发现，何首乌致肝损伤患者中，有很大比例是采用水煎代茶饮、泡酒、打粉水冲服等不合理用药方式。已有研究表明，饮片经打粉后，相对于块状饮片其化学成分更易煎出[2425]。那么就何首乌而言，打粉后其毒性成分是否更易煎出，从而增加了何首乌临床用药风险尚不明确。另外，目前何首乌致肝损伤物质基础尚不明确，存在一定的争议，有研究提出导致肝损伤的物质可能为大黄素等蒽醌类物质[2628]，还有研究认为肝损伤的物质为二苯乙烯苷类物质[2930]，但是均属于推测，尚缺乏可靠的理论依据。故本实验从临床用药的角度出发，测定不同规格何首乌水煎液中主要成分的溶出量，通过何首乌肝细胞毒性检测方法，评价不同规格何首乌水煎液对肝细胞毒性的影响，同时通过相关分析初步探索何首乌可能的肝毒性成分，以期为临床规范用药提供一定的理论参考。
1材料
Agilent 1200 高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；G1315D DAD紫外检测器（安捷伦科技有限公司）；Agilent ChemStation色谱工作站（安捷伦科技有限公司），AB265S 1/10万分析天平（瑞士MettlerToled公司），Synergy H1多功能酶标仪（美国BioTek公司），TC10TM自动细胞计数器（美国BioRad公司，506BR2780），LGJ18型冷冻干燥机（北京西四环科学仪器厂），高压蒸气灭菌器（重庆雅马拓科技有限公司，SN510C），台式低速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司），二氧化碳恒温培养箱（NAPCO公司），洁净工作台（北京冠鹏净化设备责任有限公司），超声波清洗机（南京新辰科技有限公司），回流提取装置。
没食子酸（中国食品药品检定研究院，批号120856），儿茶素（中国食品药品检定研究院，批号110877），顺式二苯乙烯苷（成都克洛玛生物科技有限公司，批号150526），反式二苯乙烯苷（成都普菲德生物技术有限公司，批号141101），大黄素8OβD葡萄糖苷（成都克洛玛生物科技有限公司，批号141209），大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷（成都克洛玛生物科技有限公司，批号131012），大黄素（成都普瑞法科技开发有限公司，批号14031702），DMEM培养基（美国Gibco公司，批号1621440），胎牛血清（美国Gibco公司，批号505985），胰蛋白酶（迈晨科技有限公司，批号E23AT050），青霉素，链霉素，Cell Counting Kit8（日本同仁化学研究所，批号GH688），色谱级甲醇（美国Honeywell公司，批号20141202），磷酸，超纯水，其余试剂均为分析纯。
何首乌（批号13101701）购于北京绿野药业有限公司，经解放军第302医院肖小河研究员鉴定为蓼科植物何首乌P multiflorum的干燥块根。
2方法
21含量测定
211样品的制备取何首乌饮片，按边长不同筛选出小块样品（08～1 cm）和大块样品（16～18 cm）。粗粉和极细粉的制备是参照2010年版《中国药典》凡例中粉末分等标准[31]。精密称取4种规格何首乌饮片各60 g，平行操作4份，分别加10倍量蒸馏水，浸泡30 min后，加热回流提取1 h，趁热抽滤，冷冻干燥，制得干浸膏，计算得率，备用。
212对照品溶液的制备精密称取二苯乙烯苷等8种对照品适量，置于同一量瓶中，用甲醇定容至刻度，超声5 min，得到没食子酸1543 mg·L-1，儿茶素2160 mg·L-1，顺式二苯乙烯苷1543 mg·L-1，二苯乙烯苷1543 mg·L-1，大黄素8OβD葡萄糖苷926 mg·L-1，大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷690 mg·L-1，大黄素476 mg·L-1，大黄素甲醚682 mg·L-1的混合对照品溶液。
213供试品溶液的制备精密称取上述4种规格样品，分别加10倍量蒸馏水，浸泡30 min，称重，每个样品在煎煮0，15，30，45，60 min时，补足失重，精密量取200 μL提取液，离心取上清液100 μL，加入量瓶中，定容至刻度线，摇匀，022μm滤膜过滤，取续滤液，配制成10 g·L-1（以生药量计）的供试品溶液。
214色谱条件流动相甲醇（A）01%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，95%～75% B；10～20 min，75%～50% B；20～30 min，50%～30% B；30～35 min，30%～20% B；35～40min，20%～10% B；40～45 min，10% B），流速10 g·L-1，柱温30 ℃，检测波长280 nm，进样量10 μL。
215方法学考察线性关系的考察：将混合对照品溶液按214色谱条件进样1，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20 μL，记录峰面积，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线。
精密度试验： 取212项的混合对照品溶液，按214项的色谱条件连续进样6次，测定峰面积，并计算RSD。
稳定性试验：取213项下供试品溶液，按214项的色谱条件，分别于供试品制备后的0，2，4，8，12，24 h进样，测定峰面积，计算RSD。
重复性试验：取同一批何首乌小块样品，按213项的方法平行制备6份煎煮相同时间点下的供试品溶液，分别进样，测定峰面积，计算没食子酸、儿茶素、顺式二苯乙烯苷、反式二苯乙烯苷、大黄素8OβD葡萄糖苷、大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷、大黄素的RSD。
22不同规格何首乌饮片煎煮溶出的成分分析
221不同规格何首乌指纹图谱的研究将16个（4种规格，平行操作4份）何首乌样品的指纹图谱导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件（2004A版），通过色谱峰多点校正的方法，对S1～S16号何首乌样品的色谱峰进行匹配并自动生成对照指纹图谱R，以生成的对照指纹图谱为对照，计算样品的相似度。
222主成分分析和聚类分析通过建立的指纹图谱提取对应色谱峰峰面积，采用SIMCAP+110版软件对4种规格16个何首乌饮片样品进行主成分（principal component analysis，PCA）分析，考察不同规格何首乌饮片主成分煎煮溶出的总体差异，参数设置采用软件默认。通过在随机化X变量模型下对数据的解释程度值（R2X）和在随机化Y变量模型下对模型的预测能力参数值（Q2）评价模型质量[32]。16个何首乌样本采用MetaboAnalyst在线软件，按照变量间的欧氏距离进行在线的分层聚类分析。
23不同规格何首乌饮片的肝细胞毒性评价
人正常肝细胞L02细胞系，在含有10%的胎牛血清、100 U·mL-1的链霉素、100 U·mL-1的青霉素的DMEM培养基中，37 ℃，5%CO2条件下进行常规培养，实验操作均在细胞生长对数期进行。
取不同规格的何首乌样品煎煮60 min时的干浸膏，用培养基配制成16 g·L-1（以生药计）的何首乌药液，用022 μm除菌滤膜过滤。将L02细胞以7 000个/孔的浓度均匀接种在96孔细胞培养板上，培养24 h后，吸出培养基，加入配好的何首乌药液100 μL，每个样品重复6孔，反应24 h，弃去药液，避光条件下加入CCK8，培养箱培养1 h后检测450 nm处的吸光度，计算细胞抑制率。抑制率=（1-A样品/A空白）×100%[33]。
24相关分析
采用SPSS 200软件，将4种规格的何首乌，每种规格4个样品，合计16个样品煎煮60 min时7个已知成分的含量和其对应的肝细胞抑制率进行逐步回归分析，通过比较各色谱峰与毒性相关系数的大小与正负分析各成分与肝细胞毒性的相互关系[34]，初步阐明何首乌中化学成分与肝毒性的相关性。
3结果
31含量测定方法学考察结果
根据214项下条件，8种主成分的色谱分离度均大于15，典型色谱图见图1。方法学考察结果，见表1。本实验所采用方法能够有效的将8种对照品分离，分离效果好，方法操作简便，重复性好，由于水提物中蒽醌类成分较低，大黄素甲醚低于检测限，可用于何首乌饮片7种成分的含量测定。
32规格对何首乌饮片煎煮溶出的化学成分影响
按照21项下含量测定方法，测定每种规格何首乌饮片主要成分的质量分数，得到溶出量随煎煮时间的变化规律，见图2。何首乌饮片规格能影响主要成分的煎煮溶出效率，其中粉末状的饮片煎煮溶出状态不同于块状饮片，粗粉溶出效率优于极细粉，2种块状饮片的溶出效率以小块儿为优。在浸泡30 min时，极细粉的主要成分溶出量远远高于粗粉和块状饮片。在煎煮0～15 min阶段，粗粉中的主要成分迅速溶出，溶出速率远高于极细粉和块状饮片，随着颗粒尺寸的减小，主要化学成分的煎出量明显加快增强，但极细粉的溶出速率最低。在煎煮15～60 min时，粉末状饮片主要成分的溶出速率低于块状饮片，其煎煮曲线呈缓慢上升趋势。
33HPLC指纹图谱分析
根据16个何首乌样品指纹图谱的检测结果，利用相似度软件，建立了16个何首乌样品的指纹图谱，见图3，其中R为生成的对照指纹图谱，共有色
谱峰17个，经与对照品对照，峰1为没食子酸，峰4为儿茶素，峰6为顺式二苯乙烯苷，峰8为反式二苯乙烯苷，峰14为大黄素8OβD葡萄糖苷，峰16为大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷，峰17为大黄素。并且通过相似度的比较发现同一规格的样品的相似度高于不同规格的样品。
34主成分分析
在222项的方法下进行分析，得到R2X=0944，Q2=0879，其中R2X越接近1，表示模型越稳定，Q2>05表示预测率高，由此可知，该模型稳定可靠。主成分分析的PCA得分图见图4，对其进行整体性的差异性分析，以平均值为中心，可以看出同一规格的4个何首乌样本之间差异较小，不同规格何首乌样品能明显区分；并且2种块状饮片的化学成分较为相似，而粗粉和极细粉何首乌样品相似。上述研究表明，块状饮片之间化学成分类似，不同于粉状饮片，两类饮片在煎煮60 min后的化学指纹图谱存在较大差异。
35HPLC指纹图谱聚类分析
采用欧式距离对16个何首乌样品进行聚类，见图5，16个何首乌样本可以分为两大类，第一类为块状饮片（Ⅰ），第二类为粉状饮片（Ⅱ）。第一大类块状饮片中分为两小类，①样品S1～S4号聚为一类，均为大块饮片，②样品S5～S8号聚为一类，均为
小块饮片。第二大类粉状饮片中分为2小类，①样品S9～S12号聚为一类，均为粗粉，②样品S13～S16号聚为一类，均为极细粉。
36不同规格何首乌样品的肝细胞毒性
通过比较不同规格何首乌样品的肝细胞毒性发现，规格大小对其肝细胞的毒性有影响。粉状饮片毒性强于块状饮片，见图6，与大块样品比较，小块样品无显著性差异，而粗粉和极细粉样品与大块样
品具有极显著性差异（P<001），粉状药材之间区别不明显。
37多元相关分析
将煎煮60 min后的不同规格何首乌7种主要成分的含量，见表2，与肝细胞毒性进行多元线性回归分析，采用逐步回归方法，拟合得到方程：Y=0025+2986X2+6043X3-2865X6+3501X7（F=2 160206，P<005），相关系数r=0912，其中X2代表儿茶素、X3代表顺式二苯乙烯苷、X6代表大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷、X7代表大黄素。多元回归拟合方程中自变量的系数大小表示该变量
对因变量的影响程度大小，其中正负值分别表示正负相关性。从得到的拟合方程可以明显看出儿茶素、顺式二苯乙烯和大黄素与细胞毒性间具有正相关性，以顺式二苯乙烯苷最为相关，其次为大黄素，儿茶素相关性较弱，而大黄素甲醚葡萄糖苷则呈现出负相关性。分析结果提示，顺式二苯乙烯苷、大黄素、儿茶素可能为导致L02肝细胞损伤的物质基础。
4讨论
目前，在《中国药典》中何首乌含量测定方法项下关于二苯乙烯苷类和蒽醌类的含量测定是分开进行的，而且结合型蒽醌的含量是经过水解成游离型蒽醌后计算得出。本研究建立了同时测定何首乌8种主要化学成分的含量测定方法，能够快速简便的将二苯乙烯苷类和蒽醌类化合物同时测出，节约了实验时间与成本。
本实验研究表明不同规格何首乌样品对肝细胞毒性有较大影响，粉末状饮片>块状饮片，其中粗粉的水提物毒性最大，说明何首乌经打粉后肝细胞毒性增强。而临床上很多何首乌致肝损伤患者是采用打粉服用方式，增加了何首乌用药的风险，这与本实验结果一致。事实上，尽管何首乌致肝损伤报道病例逐年增多，根据国家药品不良反应中心和多家医院对不良反应报告、临床病例和文献调研发现，大部分人合理服用何首乌及其制剂是相对安全的，除了
特异质肝损伤[35]，大多数患者是由于不合理用药引起的，如没有医生指导下自行超大剂量服药。因此，建议对广大群众加强合理用药知识的普及，临床上强化何首乌合理用药管理，规范何首乌饮片的使用规格，以确保何首乌临床用药安全，避免肝损伤。
本研究经过多元相关分析，发现顺式二苯乙烯苷、大黄素、以及儿茶素与其肝毒性的相关性较强。何首乌中的主要二苯乙烯类成分2，3，5，4′tetrahydroxystilbene2Oβglucoside是白藜芦醇的一种类似物，在阳光及紫外灯照射下同样会产生其顺式异构体。有报道称白藜芦醇具有细胞毒性作用。同时，白藜芦醇等某些二苯乙烯类化合物还具有光学敏感性，在紫外照射下会出现顺反异构转换现象，其顺式结构细胞毒性强于反式结构[36]。因此，二苯乙烯苷类化合物要避光保存，何首乌泡酒时也要避光保存。另外，蒽醌类化合物也是目前推测与肝毒性相关的一类物质，在何首乌生品中，蒽醌类化合物的含量比蓼科其他常用药材如大黄、虎杖等低很多。但大黄等其他药材关于肝损伤报道却很少，所以推测何首乌的毒性可能并不只是蒽醌类或二苯乙烯类某一种成分的贡献，可能是不同类物质协同作用的结果。因此，不同成分以不同配伍比例联合后是否协同增加肝细胞毒性有待进一步研究。
本实验采用正常人肝细胞检测的细胞抑制率与临床肝损伤具有较密切的相关性，但是，体外肝细胞培养与体内肝细胞在药物转化、免疫应答、炎症反应等方面还存在一定的差异，故筛选确认何首乌肝毒性物质时仍需进一步体内实验验证。
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[责任编辑孔晶晶]