打开文本图片集
[摘要] 目的 探讨兖州卷柏乙醇提取物对人食管癌裸鼠移植瘤细胞的抑制作用。 方法 构建人食管癌裸鼠移植瘤模型，随机分成5组，每组各10只，分别灌胃给药等体积的兖州卷柏乙醇提取物高、中、低剂量组（400、200、100 mg/kg），并设置阳性对照（环磷酰胺，5 mg/kg）组和阴性对照（生理盐水，0.2 mL/只） 组。每天给药1次。给药4 d后，开始测量并计算肿瘤体积。给药20 d后，处死裸鼠，称瘤重，并计算抑瘤率，肝脏、脾脏指数。 结果 实验结束后，兖州卷柏乙醇提取物高、中剂量组的肿瘤体积均比阴性对照组小且差异有统计学意义（P < 0.01），但均比阳性对照组大且差异有统计学意义（P < 0.05）；低剂量组比阴性对照组小（P < 0.05）。高剂量组食管癌肿瘤的重量比阴性对照组小（P < 0.01），其抑瘤率为30.51%，但比阳性对照组大（P < 0.05）；中、低剂量均比阴性对照组小（P < 0.05），抑瘤率分别为18.12%和9.25%。高剂量组肝脏指数比阴性对照组小（P < 0.01）；中剂量组肝脏指数也比阴性对照组小（P < 0.05）。高剂量组脾脏指数比阴性对照组小（P < 0.05）。 结论 兖州卷柏乙醇提取可以抑制人食管癌裸鼠移植瘤细胞的生长。
[关键词] 兖州卷柏乙醇提取物；食管癌；裸鼠；抑制作用
[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）09（c）-0027-05
[Abstract] Objective To investigate the inhibitory effect of ethanol extract from Selaginella Involven （ESI） on human carcinoma of esophagus cells transplanted in nude mice. Methods The models of nude mice were transplanted with human carcinoma of esophagus， and divided randomly into 5 groups with ten mice in each group. The groups of mice were treated by oral gavage daily as follow： high dosage group with ESI （400 mg/kg）， moderate dosage group with ESI （200 mg/kg）， low dosage group with ESI （100 mg/kg）， positive control group with cyclophosphamide （5 mg/kg）； negative control group with normal saline （0.2 mL/mice）. The volumes of the tumor in the mice were measured and calculated after 4 days. After 20 days， all the mice were sacrificed for the measurements of the tumor weights and the tumor inhibition rates. The liver and spleen indexes were measured. Results After the experiment， the tumor volumes in high dosage group and moderate dosage group were decreased compared with negative control group （P < 0.01）， which increased compared with positive control group （P < 0.05）； the tumor volumes in low dosage group were decreased compared with negative control group （P < 0.05）. The tumors in high dosage group were lighter than negative control group （P < 0.01） with the tumor inhibition rate of 30.51%， which was heavier than positive control group （P < 0.05）. The tumors in moderate and low dosage groups were lighter than negative control group （P < 0.05） with the tumor inhibition rates of 18.12% and 9.25% respectively. The liver indexes in high dosage group were lower than negative control group （P < 0.01）. The liver indexes in moderate dosage group were lower than negative control group （P < 0.05）. The spleen indexes in high dosage group were lower than negative control group （P < 0.05）. Conclusion The growth of transplanted tumor of human esophagus carcinoma in nude mice can be inhibited by ESI.
[Key words] Ethanol extract from Selaginella Involven； Human esophagus carcinoma； Nude mice； Inhibition
兖州卷柏（selaginellae involventis，Sping）为卷柏科植物兖州卷柏的全草，也被民间称为地柏枝、金不换、金扁柏、石卷柏等，是多年生草本植物。传统医学认为其性味辛、甘、平、涩。中医运用兖州卷柏治疗疾病已有悠久的历史，其主治湿热黄疸、肺炎、咳喘、痔疮、痢疾、烫伤、小儿惊风等[1]。在民间关于肝病的治疗方面，兖州卷柏取得非常良好的效果[2]。研究人员运用现代药学研究方法证明了卷柏属植物中含有多种有效化学成分，如：生物碱类、黄酮类、炔酚类等。现代药理研究表明卷柏属植物具有多方面的药理活性，如抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等[3]。谢永华等[4]研究表明兖州卷柏乙醇提物对人食管鳞癌细胞有一定的抑制作用。在此基础上，本研究进一步观察充州卷柏乙醇提物对人食管癌细胞株（EC-9706）裸鼠移植瘤生长情况的影响，为其作为天然抗肿瘤药物的开发提供实验依据。
1 一般材料
1.1 药材
兖州卷柏全草购于福建省三明市宁化县草药市场，并经泉州市医药研究所苏齐主任医师鉴定为卷柏科，卷柏属，兖州卷柏植物。
1.2 试剂
人食管鳞癌细胞株（EC-9706）购自天呈科技生物公司。胎牛血清、PBS、DMSO、RPMI1640培养基（赛默飞世尔科技公司）。生理盐水（NS，福州海王福药有限公司），环磷酰胺（CTX，江苏恒瑞医药股份有限公司）。二氧化碳培养箱（HF90，上海力申科学仪器有限公司），生物安全柜（BSC-1500IIA2-X，济南鑫贝西生物技术有限公司），倒置显微镜（XG-202，南京江南永新光学有限公司），高压灭菌锅（HAV-50，日本平山制作所株式会社），电热恒温水槽（DK-600，上海精宏实验设备有限公司），天子天平（BSA1245，德国赛多利斯有限公司），台式低速离心机（L500，湖南湘仪实验仪器开发有限公司）。
1.3 实验动物
SPF级BALE/c裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司[动物合格证号SCXK（沪）2012-0002]，4～5周龄，雌雄不限，体重16～19 g，SPF级环境饲养5 d后用于实验。
2 方法
2.1 兖州卷柏乙醇提取物的制备
兖州卷柏全草用粉碎机粉碎2～4 min，过100目筛备用。称取20 g兖州卷柏干粉末，放入圆底烧瓶中，然后加入80%乙醇溶液200 mL。60℃回流提取3次，每次处理60 min。提取液过滤，旋转蒸发仪蒸发，得到1.6 g乙醇提取物浸膏。
2.2 人食管癌小鼠移植瘤动物模型的构建
人食管鳞癌细胞（EC-9706）用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养液（含青霉素和链霉素各100 U/mL）中，于37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件恒温常规培养。0.25%胰蛋白酶消化对数生长期的EC-9706细胞，用RPMI培养液将细胞密度稀释为1×108个/mL。BALB/c裸鼠右前肢腋部皮下接种0.2 mL肿瘤细胞，观察7 d，选择肿瘤直径1 cm左右的裸鼠进行实验。
2.3 分组、给药与处理
将50只裸鼠按随机数字表法分为兖州卷柏乙醇提取物高、中、低3个剂量实验组，并设置阳性对照（环磷酰胺，CTX）组和阴性对照 （生理盐水，NS）组。分别灌胃给药等体积的兖州卷柏乙醇提取物高、中、低剂量组（400、200、100 mg/kg），阳性对照 （CTX，5 mg/kg） 组和阴性对照（NS，0.2 mL/只）组。每天给药1次，连续给药20 d。给药过程中观察裸鼠生长状况和体重变化。治疗后第4天开始测量瘤长（L）和瘤宽（W），根据公式：肿瘤体积（V）=0.5×L×W2 mm3计算肿瘤体积。20 d后，用吸入二氧化碳的方法处死裸鼠，并称量肿瘤、裸鼠肝脏和脾脏的重量。根据以下公式计算抑瘤率和脏器指数。
2.4 统计学方法
采用SPSS 11.5软件，实验数据用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，组间率的比较采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 兖州卷柏乙醇提取物对裸鼠移植瘤体积的影响
给药16 d后，兖州卷柏乙醇提取物高、中剂量组的肿瘤体积均比阴性对照组小且差异有统计学意义（P < 0.05）；实验结束后，低剂量组的肿瘤体积比阴性对照组小且差异有统计学意义（P < 0.05）；而高、中剂量组的肿瘤体积均小于阴性对照组且差异有统计学意义（P < 0.01）。
给药12 d后，兖州卷柏乙醇提取物低剂量组和阴性对照组的肿瘤体积均比阳性对照组大且差异有统计学意义（P < 0.05）。给药16 d后，中、低剂量组的肿瘤体积均比阳性对照组大且差异有统计学意义（P < 0.05）。实验结束后，高、中剂量组的肿瘤体积均比阳性对照组大且差异有统计学意义（P < 0.05）；而低剂量组的肿瘤体积大于阳性对照组且差异有统计学意义（P < 0.01）。见表1。
3.2 兖州卷柏乙醇提取物对裸鼠食管癌肿瘤重量及抑瘤率的影响
实验结束后，兖州卷柏乙醇提取物高剂量组食管癌肿瘤的重量小于阴性对照组且差异有统计学意义（P < 0.01），其抑瘤率为30.51%；中、低剂量组食管癌肿瘤的重量均比阴性对照组小且差异有统计学意义（P < 0.05），其抑瘤率分别为18.12%和9.25%。
高、中剂量组食管癌肿瘤的重量均比阳性对照组大且差异有统计学意义（P < 0.05）；而低剂量组食管癌肿瘤的重量大于阳性对照组且差异有统计学意义（P < 0.01）。
兖州卷柏乙醇提取物各剂量组实体瘤的重量呈剂量与效应关系，提示兖州卷柏乙醇提取物对裸鼠食管癌移植瘤的生长有明显的抑制效果。见表2。
3.3 兖州卷柏乙醇提取物对人食管癌移植瘤裸鼠肝、脾的影响
实验结束后，兖州卷柏乙醇提取物高剂量组肝脏指数小于阴性对照组且差异有统计学意义（P < 0.01）；而中剂量组肝脏指数比阴性对照组小且差异有统计学意义（P < 0.05）。中、低剂量组肝脏指数均比阳性对照组大且差异有统计学意义（P < 0.05）。
高剂量组脾脏指数比阴性对照组小且差异有统计学意义（P < 0.05）；而中、低剂量组脾脏指数与阴性对照组比较差异无统计学意义。中剂量组脾脏指数比阳性对照组大且差异有统计学意义（P < 0.05）；而低剂量组脾脏指数大于阳性对照组且差异有统计学意义（P < 0.01）。见表3。
4 讨论
食管癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，发病年龄多发生在40岁以上，且男性发病率高于女性。其早期诊断率低，就诊时的食管癌患者有70%～80%属于晚期症状。食管癌病死率高达90%，成为近来年日益威胁人类身体健康的高危疾病。中国是世界上食管癌高发地区之一。在我国，食管癌发病率和死亡率分别占全部恶性肿瘤的第5位和第4位，每年平均约有15万人死于此病。与大部分肿瘤类似，食管癌的早期症状不明显，因此大多数患者确认时已失去治疗的最佳时期。目前治疗食管癌的主要方法有手术治疗、化学治疗、放射疗法等。由于肿瘤容易发生转移，食管癌患者的5年生存率为20%左右[5]。中晚期食管癌患者一般易发生肿瘤外侵或大面积肿瘤细胞转移等症状，不适宜用手术治疗，故一般采取保守治疗，即用化学治疗与放射治疗相结合，并辅助内科等综合学科疗法。但化学治疗和放射疗法容易对患者的自身免疫系统和正常的组织细胞产生某种程度的伤害，进而影响其治疗效果，也可能刺激肿瘤细胞的增殖，或者导致其他并发症的发生[6-7]。随着近年来对分子靶向药物治疗肿瘤效果研究的发展，由于分子靶向药物具有特异性强、疗效大、毒副作用小等特点，因而分子靶向疗法在食管癌的治疗方面也得到广泛的关注[8]。然而，其临床应用效果目前还在探索之中，还需要有更多的大样本研究试验对分子靶向药物治疗食管癌效果进行评估。因此，分子靶向药物在治疗食管癌的应用方面还有很大的局限性[9]。
食管癌早期确诊患者只有少部分适合进行手术治疗，而单纯采用化学疗法所取得的疗效往往不尽人意。目前，每种治疗食管癌的方法都各有优劣。近年来的药理研究试验提示多种中医药在治疗胃癌、食管癌、肝癌等恶性肿瘤方面有一定的疗效[10-12]。在治疗食管癌方面，中医药疗法有毒副作用较小、疗效明显等特点。外科手术治疗、化学治疗或放射治疗食管癌后，中医药疗法可以具有减缓术后不良反应、减弱放化疗毒副作用、增加患者免疫功能及其增强放化疗耐受程度等功能[13-14]。随着现代临床医学及其科学深入研究，发现中草药在预防癌症的发生、发展，及其联合医疗过程中减少毒副作用有独特的优势，并取得较好的效果。我国有着深厚的中医药理论、实践基础和丰富的天然药物资源[15]。积极开发可以促进肿瘤细胞凋亡和对肿瘤有抑制效果的中医药，将是今后治疗食管癌新方法的一个发展方向和必然趋势。
兖州卷柏，为卷柏科植物兖州卷柏的全草，广泛分布于我国的福建、浙江、广西、广东、江西、台湾等地。充州卷柏具有消炎、止痛、抗病毒、抗肿瘤及其提高免疫功能等功效[16-17]。林美珍等[18]用充州卷柏作为民间中草药治疗肝炎患者，具有显著疗效。韩国东洋科学研究所利用卷柏提取物研发出一种新药用于治疗骨质疏松症[19]。近年来，运用现代中药分离制备技术提取兖州卷柏活性成分，并对其有效成分进行药理、毒理研究取得了一定的成效。兖州卷柏中提取出一些有效成分，分别具有抗氧化、抗菌、降血压、抗肿瘤、抗病毒等效果。Seong等[20]研究表明兖州卷柏提取物具有抑制一氧化氮（NO）的功能，可以下调iNOS/IL-1β的表达，进而对痤疮细胞有一定的治疗效果。Gayathri等[21]研究发现兖州卷柏能抑制脂质过氧化反应和羟自由基活性，并且可以提高成年小鼠的免疫活性。张昊等[22]研究发现兖州卷柏的四种黄酮类化合物可以抑制人肝癌细胞HepG2的生长，并提示与甲氨蝶呤阳性对照组比较，这四种黄酮类化合物具有更强的抑制癌细胞活性。邱丹缨等[23]研究发现兖州卷柏生物碱可以有效抑制小鼠H22肝癌细胞的生长。谢永华等[24]研究表明兖州卷柏水提物具有一定的抗氧化能力，并对人食管癌细胞有一定的抑制效果。对人食管癌细胞的抑制效果随其水提物的浓度增加而提高。谢永华等[4]研究表明兖州乙醇提取物对人食管癌细胞有一定的抑制效果。对人食管癌细胞生长的抑制效果随兖州卷柏乙醇提取物浓度增大而增强。同时研究表明兖州卷柏乙醇提取物具有保护小鼠肝细胞损伤的功能。
本研究表明不同浓度的兖州卷柏乙醇提取物对人食管癌移植瘤均有一定的抑制作用，且各剂量组抑瘤效果呈剂量-效应关系。结果提示，兖州卷柏乙醇提取可以抑制人食管癌裸鼠移植瘤细胞的生长，对今后兖州卷柏的开发应用和肿瘤防治有重要的意义。
[参考文献]
[1] 陈士林，林余霖.中草药大典[M].北京：军事医学科学出版社，2006：349-353.
[2] 温扬敏.兖州卷柏的研究进展[J].医药导报，2012，31（3）：341-342.
[3] 毕跃峰，郑晓珂，史社坡，等.卷柏属植物化学成分与药理活性[J].国外医药植物药分册，2000，17（3）：97-100.
[4] 谢永华，温扬敏，罗彩林，等.兖州卷柏乙醇提取物对食管癌细胞增殖及NO_cGMP通路的影响[J].天然产物研究与开发，2016，28（3）：424-428.
[5] 李学民，汤萨，彭秀青，等.1973_2005年手术治疗食管癌患者5年生存率变化分析[J].肿瘤防治研究，2014，41（3）：237-242.
[6] 张正荣，袁昕，殷旭东，等.晚期食管癌不同化疗方案疗效对比[J].中国医药导报，2014，11（32）：42-46.
[7] 杨原源，郝大选，王建华.中国食管癌非手术治疗研究进展[J].肿瘤基础与临床，2014，27（3）：542-545.
[8] Ilson DH，Kelsen D，Shah M，et al. A phase 2 trial of erlotinib in patients with previously treated squamous cell and adenocarcinoma of the esophagus [J]. Cancer，2013，29（5）：835-837.
[9] Gold PJ，Goldman B，Iqbal S，et al. Cetuximab as second-line therapy in patients with metastatic esophageal adenocarcinoma： a Phase Ⅱsouthwest oncology group study （S0415） [J]. J Thorac Oncol，2010，5（9）：1472-1476.
[10] 王跃辉，贾海艳，张昕.食管癌国内外治疗现状文献综述[J].中国医学工程，2011，19（2）：178-180.
[11] 孟春芹，丁芋友.食管癌的中医治疗[J].长春中医药大学学报，2013，29（5）：835-837.
[12] 司银套，黄志良.食管癌中医证型分析[J].江苏中医药，2008，40（8）：65-67.
[13] 仇忠辉.中药对中晚期食管癌化疗不良反应的影响[J].中医学报，2013，28（8）：1108-1109.
[14] 郭春华，薛涛.中医药在食管癌治疗中的应用概况[J].江苏中医药，2005，26（2）：59-61.
[15] Lu P，Liang QD，Li R，et al. Effect of traditional Chinese medicine on survival and quality of life in patients with esophageal carcinoma after esophagec [J]. Chinese Journal of Integrative Medicine，2006，12（3）：175-179.
[16] 何薇，曾祖平，王永红.药用卷柏的研究概况[J].中草药，2000，31（12）：954-956.
[17] 鲁曼霞，黄可龙，施树云，等.兖州卷柏化学成分及体外抗菌活性研究[J].天然产物研究与开发，2009，21（9）：973 -975.
[18] 林美珍，许振强.兖州卷柏识别及对肝炎的治疗作用[J].海峡药学，2004，16（5）：94-95.
[19] Majin Yeul，Shimki Shuk，Leeyoon Hee，et al. Composition for prevention or treatment of osteoporosis comprising extract of Selaginellae herba：South Korea，KR201200 44451 [P].2012-05-08.
[20] Seong SJ，Su KJ，Sung GK，et al. Anti-acne activity of Selaginella involvens extract and its non-antibiotic antimicrobial potential on Propionibacterium acnes [J]. Phyt Res，2008，22（3）：335-339.
[21] Gayathri V，Asha VV，Subramoniam A. Preliminary studies on the immunomodulatory and antioxidant properties of Selaginella species [J]. India J Pharm，2005，37（6）：381-385.
[22] 张昊.兖州卷柏成分及抗肿瘤活性成分研究[D].长沙：中南大学，2009.
[23] 邱丹婴，温扬敏，谢永华，等.超声辅助提取兖州卷柏生物碱及其对H22肝癌细胞增殖抑制影响[J].食品工业科技，2013，34（10）：265-268.
[24] 谢永华，温扬敏，罗彩林，等.兖州卷柏活性物质提取及对人食管癌细胞的抑制作用[J].医药导报，2012，31（9）：1132-1135.
（收稿日期：2016-05-20 本文编辑：赵鲁枫）