摘 要：目的：提高外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量。方法：采用大肠杆菌K12菌株，含有表达某种抗体类蛋白的表达质粒，通过在发酵过程中加入甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的方式，检测不同发酵时间表达量变化情况，评估每种物质对于目的蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的影响。结果：同时加入甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的发酵批次可溶性蛋白表达量最高。结论：说明在大肠杆菌高密度发酵过程中加入甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸有助于提高目的蛋白的可溶性表达。
关键词：大肠杆菌；高密度发酵；甲硫氨酸；亮氨酸；异亮氨酸；可溶性表达
DOI：10.16640/j.cnki.37-1222/t.2018.17.032
大肠杆菌是目前常用的蛋白发酵菌体，采用高密度发酵技术（High cell density cultivation， HCDC）不仅可以减少培养体积、提高目的蛋白产量，还可以缩短生产周期，减少设备投资从而降低生产成本，能极大地提高在市场上的竞争力[1]。但外源蛋白在获得高水平表达的同时，容易形成包涵体，包涵体中的多肽链折叠错误，没有活性，必须通过复杂的复性过程才能获得功能正常的蛋白，但成功率低[2]，特别是含二硫键较多的包涵体蛋白，在复性过程中容易发生二硫键的错配，从而使蛋白质失去生物学活性。蛋白的可溶性表达则可避免变、复性过程，明显简化后续纯化工艺，保证功能蛋白的功能。因此，探索外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达具有较高的学术价值和广泛的应用前景。
目前针对于高密度发酵过程中蛋白可溶性表达的研究主要停留在对大肠杆菌宿主细胞[3]、比生长速率、诱导时机[4]、诱导温度[5]、培养基成分[6]、碳源种类[7]、表达载体启动子[8]、融合标签[9]等。关于发酵过程中补入氨基酸对可溶性蛋白表達的影响，国内目前的相关研究报道偏少。国外研究表明，在大肠杆菌表达蛋白期间，正亮氨酸残基的引入会导致正常合成的蛋白结构或功能改变[10]，引起可溶性蛋白表达量的降低。在发酵过程中，补入甲硫氨酸，可以确保细胞获得过量的甲硫氨酸，从而减少了甲硫氨酰tRNA不正确的加载正亮氨酸的概率。甲硫氨酸的加入可以抑制正亮氨酸的作用[11]，从而维持菌体蛋白合成的正常结构和功能。亮氨酸可以抑制酶参与正缬氨酸和正亮氨酸的合成，但是，亮氨酸同样影响细胞功能造成发酵结束时的细胞密度偏低。额外加入的异亮氨酸，则可以极大得增加重组蛋白产量[12]。其他防止正亮氨酸错误渗入细胞蛋白的方式还有删除亮氨酸操纵子等[13]。
本文利用我公司现有的含有抗体质粒的大肠杆菌K12菌株，通过在发酵过程中分别加入甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，观察对于目的蛋白可溶性表达量的影响。
1 实验材料与方法
1.1 试剂
甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、硫酸镁、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钾、硫酸铵购自国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖购自西王药业有限公司；胰蛋白胨和酵母粉购自OXOID公司。
1.2 主要仪器
Bioflo415型发酵罐为NBS公司产品；电子天平为北京赛多利斯仪器有限公司产品；pH电极、溶氧电极为Pall公司产品；高速冷冻离心机为长沙市鑫奥仪器有限公司产品；电泳仪为Bio-Rad公司产品；AKTA纯化系统为GE公司产品。
1.3 发酵方法
将保存于-70℃的大肠杆菌K12菌株转种到LB培养基中，按0.2%接种量转种，30℃，150r/min，过夜培养后作为一级种子。将一级种子按10%的接种量接种发酵罐，调节维持溶氧30%以上，pH7.0±0.3左右，温度30°C，培养时间约50 h。在OD550=40时分别补入终浓度为21mmol/L的甲硫氨酸、终浓度为12mmol/L的亮氨酸和终浓度为15mmol/L的异亮氨酸。不加入各种氨基酸的作为对照批次。发酵过程中测量菌液OD550，每隔5h取发酵液离心，收集菌体，称取计量不同时间点的菌体湿重。
1.4 表达量检测方法
取上述菌体15g进行超声破碎，将超声后菌液离心，取上清，利用Protein G色谱柱，检测可溶性蛋白表达量。
2 结果
2.1 可溶性蛋白表达量
三种氨基酸同时补入的发酵批次可溶性表达量最高。补入甲硫氨酸和异亮氨酸的发酵批次与只补加异亮氨酸的发酵批次可溶性表达量接近，均高于对照批次。补入甲硫氨酸的发酵批次、补入亮氨酸和异亮氨酸的发酵批次可溶性表达量与对照批次相近。补入甲硫氨酸和亮氨酸的发酵批次与只补加亮氨酸的发酵批次表达量均明显低于对照批次。结果见图1。
2.2 下罐菌体湿重
以上几批发酵菌体，补入甲硫氨酸和亮氨酸的发酵批次菌重较低，10L发酵液收得950g菌，补入亮氨酸的发酵批次下罐菌体湿重最小，10L发酵液仅收得880g菌。其余批次菌体湿重相近，均在1.2kg左右。结果见表1。
3 讨论
高密度发酵是在保证生长速率的前提下，尽可能提高细胞密度，使体积生产率大幅提高[14]。在大肠杆菌高密度发酵过程中，减少包涵体形成和提高蛋白可溶性表达，有助推动基因工程蛋白药物生产的发展和技术进步。
本文通过一系列实验比对，清晰反映出几种氨基酸在大肠杆菌发酵可溶性蛋白表达过程中发挥的不同作用。亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸均加入的发酵批次可溶性蛋白表达量要明显高于只加入甲硫氨酸和异亮氨酸的发酵批次，说明亮氨酸的加入有助于提高可溶性蛋白表达量。但同时，只加入亮氨酸的发酵批次其表达量是7批发酵批次中最低的，结合其对下罐菌量的影响，不难看出，亮氨酸会影响正常的细胞功能，造成细胞密度偏低。只加入甲硫氨酸和亮氨酸的发酵批次其可溶性蛋白表达量和菌量也低于对照批次，且明显低于同时加入三种氨基酸的发酵批次，说明异亮氨酸的加入可以抑制亮氨酸对细胞密度产生的不良影响。只加入亮氨酸和异亮氨酸的发酵批次其表达量与对照批次相近，再引入甲硫氨酸后表达量有了明显提升，说明在发酵过程中补入甲硫氨酸，确保细胞可以获得过量的甲硫氨酸，可以保护目标蛋白的正常结构和功能特性，提高可溶性蛋白表达量。
从图1中可以看出，在发酵25-30h，蛋白表达初期，不同批次发酵菌体可溶性蛋白表达量即出现明显区分，发酵后期表达量变化不大。说明可溶性蛋白表达的关键时间在于表达初期，一旦目的蛋白过多得错误折叠形成包涵体，在发酵后期很难再提高目的蛋白的可溶性表达量。因此，几种氨基酸应在发酵前期、目的蛋白表达前进行补加。
通过以上实验分析，我们可以得出如下结论：在发酵前期加入亮氨酸有助于提高可溶性蛋白表达量，但同时会对细胞功能产生影响，造成菌体密度偏低；异亮氨酸则可以拮抗亮氨酸对细胞密度产生的不利影响；甲硫氨酸的加入可以明显增加可溶性蛋白表达量，与上述两种氨基酸一起协同作用的效果最优。
综上所述，在大肠杆菌高密度发酵前期同时补入甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，有助于提高目的蛋白的可溶性表达量。
参考文献：
[1]李民，陈常庆.重组大肠杆菌高密度发酵研究进展[J].生物工程进展，2000，20（02）：26-31.
[2]刘爽，胡宝成.原核系统可溶性表达策略[J].生物技术通讯，2005，16（02）：172-175.
[3]刘启刚，代云見，张勇侠等.抗IgE单链抗体在大肠杆菌中可溶性高效表达条件的研究[J].中国生物工程杂志，2012，32（11）：23-28.
[4]朱红裕，李强.外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达策略[J].过程工程学报，2006，6（01）：150-155.
[5]王园园，王金凤，蔡欣等.重组人KGF-2的制备及生物学活性研究[J].军事医学科学院院刊，2008，32（01）：34-38.
[6]余波，程安春，汪铭书.大肠杆菌中重组蛋白可溶性表达的研究进展及展望[J].黑龙江畜牧兽医，2008（10）：19-20.
[7]杨彩云，杜慈，黄平等.重组AiiA蛋白可溶性表达及发酵条件优化[J].江西农业大学学报，2011，33（06）：1219-1227.
[8]李振国，徐明波，牛罡.在大肠杆菌周质表达重组蛋白的研究进展[J].药物生物技术，2011，18（01）：73-76.
[9]吴珊珊，朱芸，陈珊珊等.融合标签在蛋白质可溶性表达中的应用进展[J].化工进展，2014，33（04）：993-998.
[10]M·K·莱尔德，K·维拉瓦力.用于防止正亮氨酸错误地掺入蛋白质中的方法和组合物[P].中国专利：201380048535.X，2015-05-27.
[11]Nurit Bar-Nun，Alfred M.Mayer. Efferct of norleucine on growth，protein and catechol oxidase synthesis in tobacco suspension cultures[J].Phytochemistry，1985，24（10）：2161-2166.
[12]Macdonald，Andrew，C.，Abu-Absi，Nicholas，Inlow，Duane，et al.Preventing nor-valine and norleucine misincorporation in recombinant proteins[P].US Patent：2007005963，2007-09-13.
[13]Papaneophytou P，Kontopidis G.Statistical approaches to maximize recombina-nt protein expression in Escherichia coli：A general review[J].Protein Expression and Purification，2014（94）：22-32.
[14]谢萌，徐鑫，咸漠等.重组大肠杆菌高密度发酵产甲羟戊酸动力学[J].生物加工过程，2015，13（06）：70-74.