摘要：植物抗病基因在植物抗病过程中起重要作用。综述了植物抗病基因的克隆方法，结构特点，作用机制以及未来的发展前景。
关键词：R-基因；克隆方法；结构特点；作用机制
中图分类号：S432.2+3；Q785 文献标识码：A 文章编号：0439-8114(2008)05-0598-03
Advance on Plant Resistance Gene Research
SUN Wen-li1，2，3，LIU Yu-hui2，3，WU Yuan-hua1，FU Jun-fan1
(1. Plant Pathology Department，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110161，China；
2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；
3. Important Scientific Engineerings of Gene Resources and Gene Improvement of China＇s Crops，Beijing 100081，China)
Abstract：R gene played an important role in defending the disease. This paper reviewed the gene cloning，structure characteristic，function mechanism and the foreground of R gene.
Key words：R gene，gene cloning，structure characteristic，function mechanism
R基因在植物的病害防御过程中起着非常重要的作用。植物时刻受到周围各种潜在病原菌的侵染。一旦病原菌侵入植物表皮，将遇到R基因和avr基因的互作，即植物的非寄主抗病性[1]。随之所产生的现象包括局部细胞坏死(过敏性细胞死亡)，木质素和胼胝质形成，以及所有与抑制病原菌生长和病害发生相关的抗菌物质产生。病原菌还有可能通过不同的途径赋予植物长期的系统抗性诱导系统免疫，使植物能抵抗其他相似病原菌的侵染[2]。随着分子生物学的发展，更多的植物抗病基因克隆方法及作用机制逐渐为人们所发现，也有更多的植物抗病基因的功能得到了证实。
1 R基因的克隆方法
1) 表型基因克隆法：利用表现型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆植物基因就是表型克隆。表型克隆在策略上试图将表型基因与结构基因表达的特征联系起来，从而分离特定的与表型相关的基因，力求不必事先知道基因的生化功能或图谱定位，根据基因的表达效应就能直接分离该基因。
2) 转座子标签技术：转座子标签技术是比较经典的方法，是将转座子或T-DNA插入到欲分离基因的内部，基因发生突变而被标识，然后利用插入<=6片段做探针克隆到抗病基因。
3) mRNA差异显示法：是由Peng Liang等人在1992年建立的筛选基因差异表达的有效方法。它是将mRNA逆转录技术和PCR技术相结合的一种RNA指纹图谱技术。具体操作流程如下：组织样品总RNA的提取→去除RNA样品中的微量DNA→设计引物序列→逆转录归类反应体系的建立→PCR选择性扩增→mRNA DD-PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳→差异表达条带的回收→回收条带的再次扩增→二次扩增产物的克隆、测序和GenBank查询→Northern Blot和Dot Blot杂交。
4) 功能克隆：即利用病害已知的遗传损伤而引起的生化功能如蛋白质氨基酸缺陷的信息进行基因定位，进而克隆该致病基因。
5) 同源序列克隆基因：根据已知的抗病基因设计引物，从相近物种中克隆其同源基因。
6) DNA芯片技术：一种大规模集成的固相杂交，是指在固相支持物上原位合成(in situ synthesis)寡核苷酸或者直接将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交。通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息(基因序列及表达的信息)。
7) 图位克隆法：针对寄主植物与病原菌互作的遗传模式(即与亲和性因子相关的互作模式或与非亲和因子相关的互作模式)创造R基因近等基因系(near isogenic line，NIL)及作图群体材料。由于常用的F2代作图群体不很稳定，目前发展了以双二倍群体DHL(double haploid population)、重组自交系RIL(recombinant inbred line)以及回交世代为材料。之后用RAPD和RFLP等方法对R基因进行定位，找到与R基因紧密连锁的分子标记，并以此作为起始探针，借助“染色体步行(chromosome walking)”或“染色体登陆(chromosome landing)”，在含目的R基因的植物基因组YAC或BAC文库中筛选分离出目的基因，并通过转化互补试验进行验证。
8)生物信息学的方法用于新基因的发现和鉴定。表达序列标签EST(expressed sequence tags)是基因表达的短cDNA序列，它们携带完整基因某些片段的信息。大多数情况下，EST克隆并不跨越基因的全长区，但有许多生物信息学工具可以帮助获取某一基因的全长转录体信息及其在染色体作图中的精确定位。近几年EST数据库的快速增长，增加了从EST出发寻找新基因的可能，特别是从试验测得的与功能联系的新EST发现新基因的可能性更大，通过对已知功能的抗性基因EST序列片段的拼接，以及EST序列和基因组序列的比对，可以寻找新的全长抗性基因[3]。
2 已经克隆得到的R基因及分类
第1个植物抗病基因Hm1是从玉米中分离得到的。Johal和Briggs利用转座子标签法首次从玉米中克隆到抗圆斑病基因Hm1。该基因编码依赖于NADPH的HC毒素还原酶，该酶能降解玉米圆斑病菌(Cochliobolus carbonum)生理小种1所产生的毒素，从而使玉米获得抗性[4]。据不完全统计，到2006年已克隆的植物抗病基因有51个，其中大部分基因从双子叶模式植物番茄(Lycopersicum esculent um)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)中获得。在粮食作物中，人们已克隆到15个抗病基因，其中水稻(Oryza sativa)5个、马铃薯(Solanumt uberosum)4个、大麦(Hordeum vulgare)3 个、玉米(Zea mays)2个和小麦(Triticum aestivum)1 个(表1)[5]。
尽管R基因之间的序列同源性很低，但是这些R基因编码的蛋白也具有一些相似的结构特征，根据这些结构特征，已经克隆的R基因可以分为5个大类：STK，LRR-TM，NBS-LRR，LRR-TM-STK和Hm1。
1) STK类R基因如番茄Pto基因，其产物是一个没有LRR结构域，位于细胞质内的典型的丝氨酸-苏氨酸激酶(Ser-Thrkinase)，通过丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化来传递信号[6]。目前已经有证据表明Pto蛋白能与相应无毒基因avrPto的产物相互作用。
2) LRR-TM类R基因的基因产物为锚定于细胞膜上的糖蛋白受体，包括3个区域：LRR结构域，跨膜区域(transmembranedomain，TM)和很短的胞内区域(仅有数十个氨基酸残基)。信号肽决定了它是胞外输出的。例如：番茄抗叶霉病不同生理小种的基因Cf-2、Cf-4、Cf-5、Cf-9和Hcr9-4E[7]，以及甜菜抗包囊线虫的基因Hs1pro-1[8]。
3) NBS-LRR类R基因的共同特点：在它们编码蛋白的近N端处存在着核苷酸结合位点(nucleotidebindingsite，NBS)。而在它们的近C端则存在着富含亮氨酸的重复序列(leucine-richrepeat，LRR)。LRR是蛋白与蛋白相互作用的一种典型结构，它是由十多个β折叠-环-α螺旋基本单位串联形成的空间构型，呈蹄铁(horseshoe)状的结构。这些膜受体的LRR结构伸展于细胞外，蹄铁状结构的凹陷处便是结合多样性配体的部位。该类R基因又可分成3个亚类，即LZ-NBS-LRR亚类，如RPS2、PRS5、RPP8、RPP13、RPM1、Rx2、Prf、Mi基因；TIR-NBS-LRR亚类，如RPS4、RPP5、N、L6、L11、M基因；NBS-LRR亚类，如I2、Xa1、Pib、Bs2、Cre3基因。
4) LRR-TM-STK类R基因，如水稻抗白叶枯病基因Xa21编码的蛋白是一类受体蛋白激酶[9]，它既含有与Cf-9蛋白相似的胞外LRR受体结构域，又含有与Pto蛋白相似的胞内PK结构域，在这两个区域之间存在一个跨膜区。
5) Hm1类R基因为玉米抗HC-毒素基因Hm1。玉米圆斑病菌(C.carbonum)1号小种产生HC-毒素，它是一个环状的四肽。当玉米在位点Hm1隐性纯合时，该四肽是有毒致命的。研究发现显性的Hm1编码HC-毒素还原酶(HCTR)，它依赖于NADPH。虽然Hm1被认为是第1个被克隆的小种专化性抗病基因，但它不是真正的抗病基因，因为它的抗病作用并没有一系列的信号传导，HC-毒素合成也不止1个基因[10]。该基因的克隆不仅对玉米圆斑病的防治有重大意义，且对植物抗病基因研究，尤其抗毒素研究具有重大意义。
3 R基因的作用机制
多年研究结果表明，诱导防卫反应是由植物特异抗病基因介导完成的[11]。从目前来看，其至少有5类不同的作用机制。
1)抗病基因编码产物能钝化病原菌侵染时产生的毒素，进而抑制病原菌的繁殖。如Johal和Briggs克隆的世界上第1个植物抗病基因Hm1[10]。该基因能编码依赖于NADPH的HC毒素还原酶，该酶能使玉米圆斑病菌生理小种1所产生的毒素失活，从而使玉米获得抗性。
2) 显性基因能编码病原菌致病性的靶标物。若植物缺乏该靶标物就会产生抗性。如玉米线粒体基因T-urfl3，该基因不仅能编码与雄性不育有关的蛋白，也能编码与病原菌(Bipolaris maydis)生理小种T分泌毒素亲和的产物，导致玉米与病原菌发生亲和性互作，即植株感病。而缺乏该基因的玉米品种则抗该种病原物[12]。最近，Vogel等在拟南芥抗白粉病研究中也发现类似的机制[13]。
3) 抗病基因表达产物直接引发抗病反应。到目前为止，只在大麦中发现这种作用机制。研究发现，大麦显性基因Mlo编码由534个氨基酸残基组成的分子量为60 kDa含7个跨膜域的膜锚定蛋白，它可能是植物细胞死亡和其他防卫系统的负调控因子，而含隐性基因mlo的植株则能抵抗病原菌(Erysiphe graminis f. sp. hordei)的侵染[14]。
4)植物抗性基因表达产物能特异性识别病原菌中相应无毒基因编码的产物，并产生信号分子，这些信号分子经信号传递因子传递后，开启植物防卫基因的表达，最终对病原菌产生抗性。如蛋白磷酸化、Ca++浓度变化、活性氧变化、水杨酸变化和离子流等[15]。植物防卫基因的表达主要包括谷胱甘肽S转移酶、过氧化物酶、细胞壁蛋白、蛋白酶抑制剂、水解酶(如几丁质酶和1，3-b葡聚糖等)及涉及次级代谢的病程相关(pathogenesis-related，PR)蛋白和酶等[16]。
5)编码植物新陈代谢相关酶的基因在植物病害防治中起关键性作用。越来越多的实验证据表明，植物新陈代谢中某些酶的组成型表达，在植物的抗病性中起关键性作用[17]，例如，调控S-腺苷甲硫氨酸甲基化代谢循环的关键酶植物腺苷激酶(adenosin kinase)在植物抗病毒抗性中起作用[18]；调节植物C新陈代谢的SNF1激酶与植物抗病毒抗性相关[19]。拟南芥NHO1(nonhost，NHO1)基因编码一种甘油激酶，植物对丁香假单胞菌非毒性小种的抗性互作需要NHO1的参与，而丁香假单胞菌的毒性小种通过茉莉酸信号途径，强烈抑制植物NHO1基因的表达[20]。Taler等认为，野生香瓜过氧化物体中乙醛酸氨基转移酶的表达，保护植物使之免受霜霉病菌的侵害，是植物另一种形式的“酶学抗病性”(enzymatic disease resistance)[21]。
4 R基因在植物抗病中的应用及展望
植物抗病基因的发现已使得多种植物病害得到了成功防治。例如水稻白叶枯病、番茄叶霉病、甜瓜霜霉病等等。随着分子生物学，植物抗病基因工程的发展，R基因的克隆方法已越来越多，必将有更多的抗病基因为人们所发现。这也将为利用传统育种方法或转基因手段培育抗病品种提供更多的基因资源。
参考文献：
[1] DANGL J，JONES J D G. Plant pathogens and integrated defence responses to infection [J]. Nature，2001，411，826-833.
[2] FEYS B J，PARKER J E. Interplay of signaling pathways in plant disease resistance[J]. Trends Genet. 2000，16，449-455. [3] HATTORI J，OUELLET T，TINKER N A. Wheat EST sequence assembly facilitates comparison of gene content s among plant species and discovery of novel genes[J].Genome，2005，48 (2)：197-206.
[4] JOHAL G S，BRIGGS S P.Reductase activity encoded by the HM1 disease resistance gene in maize[J]. Science，1992，258：985-987.
[5] 王忠华，贾育林，夏英武. 植物抗病分子机制研究进展[J].植物学通报，2004，21 (5)：521-530.
[6] MARTIN G B，WILLIAMS J G K，Tanksly S D. Rapid identification of markers linked to a pseudomonas resistance gene in tomato by using random primers and near-isogenic lines[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1991，88：2336-2340.
[7] JOOSTEN MHAJ，DE WIT PJGM. The tomato Cladosporium fulvum interaction：a versatile experimental system to study plant-patogen interactions[J]. Annu Rev Phytopathol，1999，37：335-379.
[8] CAID G，KLENE M，KIFLE S，et al. Positional cloning of a gene for nematode resistance in sugar beet[J]. Science，1997，275：832-834.
[9] SONG W Y，WANG G L，CHEN L L，et al. A receptor kinase-likeprotein encoded by rice disease resistance gene，Xa21[J]. Science，1995，270：1804-1806
[10] JOHAL G S，BRIGGS S P.Reductase activity by the HM1 disease resistance gene in maize[J].Science，1992.258：985-987.
[11] DANGL J L，JONES J D G. Plant pathogens and integrated defense responses to infection[J].Nature，2001，411：826-833.
[12] BRAUN C J，SIEDOW J N，WILLIAMS M E，et al.Mutations in the maize mitochondrial T-urfl3 gene eliminate sensitivity to a fungal pathotoxin[J].Proc Natl Acad Sci USA，1989，86：4435-4439.
[13] VOGEL J，SOMERVILLE S，VOGEL P，et al. Isolation and characterization of powdery mildew-resistant Arabidopsis mutants[J]. Proc Natl Acad Sci，2000，97：1897-1902.
[14] BFISCHGES R，HOLLRICHER K，PANSTRUGA R，et al. The barley Mlo gene：a novel control element of plant pathogens resistance[J]. Cell，1997.88：695-705
[15] XICAI YANG，YIN YIE，FENG ZHU，et al. Ribozyme-mediated high resistance against potato spindle tuber viroid in transgenic potatoes[J].Proc Natl Acad Sci USA. 1997，94：4861-4865.
[16] BAOLONG ZHU，TONY H H CHEN，PAUL H LI. Analysis of Late-blight disease resistance and freezing tolerance in transgenic potato plants expressing sense and antisense genes for osmotin-like protein[J]. Planta，1996，198(1)：70-75.
[17] ECKARDT N A. Aminotransferases confer ‘enzymatic resistance’ to downy mildew in melon[J]. The Plant Cell ，2004，16(1)：1-3.
[18] WANG H，HAO L，SHUNG C Y，et al. Adenosine kinase is inactivated by geminivirus AL2 and L2 proteins[J].Plant Cell，2003，15：3020-3032.
[19] HAO L，WANG H，SUNTER G，et al. Geminivirus AL2 and L2 proteins interact with and inactivate SNF1 kinase[J]. Plant Cell，2003，15：1034-1048.
[20] KANG L，LI J，ZHAO T，et al. Interplay of the Arabidopsis nonhost resistance gene NHO1 with bacterial virulence[J].Proc Natl Acad Sci USA.2003，100：3519-3524. [21] TALER D，GALPERIN M，BENJAMIN I. Plant eR genes that encode photorespiratory enzymes confer resistance against disease[J]. Plant Cell，2004，16：172-184.
(责任编辑 昌炎新)