【摘 要】目的：探讨慢性肺动脉栓塞疾病肺组织的差异蛋白，并对差异表达进行进一步验证。方法：制备肺动脉栓塞动物模型20只，对照组20只，进行肺组织蛋白质组学差异比较。结果：通过检测发现，观察组患者的蛋白组分含量较对照组均较低，其中APOL1差异最明显，比值为0.34（p<0.05）。结论：APOL1可以作为慢性肺栓塞临床诊断的危险因素之一。
【关键词】慢性肺动脉栓塞；蛋白质组学
【中图分类号】R563.4 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）13-0468-01
慢性血栓栓塞性肺动脉高压栓子来源于急性肺动脉栓塞或者长期的原位肺动脉栓塞造成的，它是初始血栓溶解不全、深静脉血栓反复脱落造成的[1]。本研究从蛋白质水平上，通过比较分析慢性肺动脉栓塞症发生过程中的差异蛋白表达谱以及特异标志蛋白，为慢性肺动脉栓塞症的诊断、治疗以及发病机制提供理论依据。现将方法与结论阐述如下：
1 材料与方法
1.1 建立兔慢性肺动脉栓塞疾病模型
血凝块注入法造模：取体重在2.5kg左右的新西兰大白兔40只，分为实验组与对照组。1%戊巴比妥腹腔注射麻醉。从腹主动脉中抽取2ml左右血液，置于含有凝血酶的器皿中，静置24小时，等渗氯化钠溶液冲洗，去掉血清，将栓子剪成0.5mm大小。加入少量生理盐水后，将25个栓子注射入实验组大白兔颈静脉中，2周后再次注射栓子造模。对照组单纯注射生理盐水。通过肺动脉血管造影检查确定造模成功。肺动脉栓塞动物模型20只，对照组20只。
1.2蛋白质提取
取2g实验组与对照组肺组织，将其放置在研钵中，置于冰上行低温操作，用眼科剪将椎间盘剪成大小为1mm×1mm×1mm。液氮冰浴条件下将肺组织研磨碎，置入5.0ml Eppendorf 管中，将1g肺组织加入2.5～3ml裂解液中，振荡60分钟，20，000g/min，4℃离心1小时，进行蛋白质浓度定量检测。
双向凝胶电泳（2-DE）：包括了IFE和SDS-PAGE等步骤。
IFE：分别用已加入18 mM DTT的泡胀液Ⅰ含400μg蛋白的样品至255μl，混匀后加入IPG胶条槽中。IPG胶条（13cm，3-10NL）胶面朝下放入胶条槽中，均匀接触泡胀液并不留气泡，加700μl胶条覆盖液，减少蒸发和尿素结晶，槽上加盖，置于IPG Phor水平电泳仪电极板上，盖上安全盖。泡胀和聚焦在20℃下自动进行，25μA/胶条，总伏小时约55-60Kvh。
SDS-PAGE ：
1.2.1 平衡：等电聚焦电泳结束后，用双蒸水将IPG胶条上的覆盖液洗掉，水沥净，IPG胶条放入试管内，支持膜贴管壁，先后在SDS平衡液Ⅰ和平衡液Ⅱ中各平衡15 min。
1.2.2 灌胶：IPG胶条平衡的同时灌胶，本研究采用常用的分离14-100KDa范围蛋白的12.5%均一胶，凝胶配方见表。水饱和正丁醇封胶，水平静置不少于30 min。
转移：胶凝后，水冲净正丁醇。将平衡好的IPG胶条转移至SDS-PAGE胶上端（胶条两测及与PAGE胶接触面不留气泡），0.5%的琼脂糖（40-50℃）封胶。
通过双向凝胶电泳分离蛋白、银染，PD-Quest图像分析，选择、切取蛋白点原位酶解得到肽混合物，经过LCQ-MS-MS分析得到肽质纹谱，肽序列标签。进行数据库检索，蛋白质鉴定。
1.3 统计学分析
对所有数据均采用SPSS15.0进行分析，对计数资料采用卡方检验，检验水准设定为a=0.05，当p<0.05时，认为其具有统计学差异性。
2 结果
2.1通过检测发现，观察组患者的蛋白组分含量较对照组均较低，其中APOL1差异最明显，比值为0.34（p<0.05）。
3 讨论
原发性慢性肺动脉栓塞是肺动脉原位血栓形成或急性肺动脉栓塞引起，继发性慢性肺动脉栓塞是因为血栓不能够完全溶解脱落、深静脉血栓形成加之反复脱落等引起。病理改变表现为肺小血管痉挛、血管内膜损伤、弹性纤维增多、血栓机化等。引起肺动脉慢性炎症继发增厚，管腔变窄闭塞，肺动脉压力增高、发展为慢性肺动脉栓塞症[2]。因为其临床表现不具备特异性、造成漏诊及误诊，肺动脉造影可以做出诊断。慢性肺动脉栓塞症因其诊断困难、预后较差。手术介入有肺动脉内膜剥脱术，但其治愈率仍较低。因此，认识慢性肺动脉栓塞症的疾病发生发展规律具有重要意义，它可以有效的提高患者生命质量。
国内李圣清等[3]首次运用蛋白质组学在急性肺动脉栓塞大鼠血清未祛除其中的高丰度蛋白，找出差异蛋白点28个，鉴定出了24个蛋白，归纳为6大类：分别为补体蛋白、转运蛋白类、快速时相蛋白类、脂蛋白类、细胞周期相关蛋白、血清蛋白酶。这些差异表达蛋白分子的鉴定为我们寻找肺栓塞的诊断标志物提供了线索。
这些差异表达蛋白分子的鉴定为我们寻找肺栓塞的诊断标志物提供了线索。蛋白质组学是一门新兴的学科，它可以对蛋白质的性质特征进行鉴别，对心血管疾病发生过程中的差异蛋白进行鉴定，成为早期诊断、治疗心血管疾病的方法，对疾病的转归有着重要影响[3]。本研究寻找慢性肺动脉栓塞模型中蛋白质组学差异，对差异蛋白进行分离鉴定，以期找到疾病的特殊标记蛋白，得出了APOL1在慢性肺动脉栓塞中具有重要作用，以期指导慢性肺栓塞的诊断和临床治疗。
参考文献
[1] Anderson FA Jr，Wheeler HB，Goldberg RJ，et al.Apopulation-based perspective of the hospital incidence and case-fatality rates of vein thrombosis and pulmonary embolism.The Worcester DVT Study.Arch Intern Med.1991；151（5）：933-938.
[2] 陆慰萱，王辰.肺循环病学[M].北京：人民卫生出版社，2007：491-503.
[3] Anderson FA Jr，Wheeler HB，Goldberg RJ，et al.Apopulation-based perspective of the hospital incidence and case-fatality rates of vein thrombosis and pulmonary embolism.The Worcester DVT Study.Arch Intern Med.1991；151（5）：933-938.
本项目受广州市番禺区科技项目资助，项目名称：兔慢性肺动脉栓塞的比较蛋白质组学研究，编号：2011-Z-03-04