摘要：为了探究中华绒螯蟹颤抖病螺原体（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｉｓ）在江苏省的分布，以２００３年至２００９年从江苏省养殖池塘收集的发病中华绒螯蟹（Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）为研究对象，利用螺原体体外培养、光电镜检测和１６ Ｓ－２３ Ｓ ｒＲＮＡ基因间隔区序列比较等方法进行了系统分析。结果表明，Ｓ． ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｉｓ是一种广泛分布于江苏省养殖中华绒螯蟹体内的病原微生物，它们不仅在７月底８月初的高温季节引起中华绒螯蟹发病和暴发性死亡，还能在３月和１１月等低温季节引起部分中华绒螯蟹的发病和死亡，其严重危害中国江苏省中华绒螯蟹养殖业的健康发展。
关键词：中华绒螯蟹（Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）；中华绒螯蟹颤抖病螺原体（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｉｓ）；１６ Ｓ－２３ Ｓ ｒＲＮＡ基因间隔区序列
中图分类号：Ｓ９６６．１６；S945.19文献标识码： Ａ文章编号：0439－８114（２０11）17－3632-03
Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ １６ Ｓ－２３ Ｓ ｒＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ Ｒｅｇｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｉｓ
ＨＵＡＮＧ Ｙｉｎｇ，ＹＥ Ｘｉｎ，ＨＵ Ｃｈｕａｎｇ－ｘｉａｎ，ＢＩ Ｋｅ－ｒａｎ
（School of Marine Science and Technology， Ｈｕａｉｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ ２２２００５， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｉｓ， ａ ｎｏｖｅｌ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｗｈｉｃｈ ｃａｕｓｅｓ ｔｒｅｍｏｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｉｔｔｅｎ ｃｒａｂ（Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）， ｉｎ Ｊｉａｎｇｓｕ ｐｒｏｖｉｎｃｅ， ｄｉｓｅａｓｅｄ ｃｒａｂｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ２００３ ｔｏ ２００９ ｉｎ Ｊｉａｎｇｓｕ ｐｒｏｖｉｎｃｅ． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｐａｔｈｏｇｅｎ， ｏｐｔｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ １６ Ｓ－２３ Ｓ ｒＲＮＡ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｒｅｇｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗere ａｄｏｐｔｅｄ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｓ． ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｉｓ ｗａｓ ａ ｗｉｄｅｌｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｉｎ Ｊｉａｎｇｓｕ， ｗｈｉｃｈ ｃａｕｓｅｄ ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｉｔｔｅｎ ｃｒａｂ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｉｎ ｈｏｔ ｓｅａｓｏｎｓ of March and November， ｂｕｔ ａｌｓｏ ｉｎ ｃｏｏｌ ｓｅａｓｏｎｓ， ｔｈｕｓ ｉｔ ｗａｓ ａ ｓｅｒｉｏｕｓ ｔｈｒｅａｔ for ｃｒａｂ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｉｎ Ｊｉａｎｇｓｕ pｒｏｖｉｎｃｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｉｔｔｅｎ ｃｒａｂ （Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）； Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｉｓ； １６ Ｓ－２３ Ｓ ｒＲＮＡ intergenic region ｓｅｑｕｅｎｃｅ
中华绒螯蟹（Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）是中国特有的水产养殖珍品，具有重要的经济价值。随着其养殖的集约化和规模化发展，各种病害已经成为危害养蟹业的重大难题。在中华绒螯蟹众多病害中，颤抖病是最为常见、危害较严重的一种，有的地方发病率高达９０％以上，死亡率达８０％～１００％，发病严重的养殖池塘甚至出现绝产，损失极其惨重。为解决该类疾病问题，研究人员围绕其病因、病原、致病机理、防治措施等方面开展了大量研究。２００４年，Ｗａｎｇ等［１］发现引起中华绒螯蟹颤抖病的主要病原是螺原体而非病毒、类立克次体、真菌或其他的环境因子。之后，他们对中华绒螯蟹颤抖病螺原体的病原形态学［２］、免疫血清学［３］和分子生物学［４］等进行了深入系统的研究，证实中华绒螯蟹颤抖病螺原体是螺原体属的一个新种，被命名为Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｉｓ［３］。本研究以江苏省患颤抖病的中华绒螯蟹为对象，对该病螺原体在江苏省的分布及其１６ Ｓ－２３ Ｓ ｒＲＮＡ基因间隔区序列特征进行分析，以了解中华绒螯蟹颤抖病螺原体感染的现状，为中华绒螯蟹颤抖病的科学防治提供理论依据。
１材料与方法
１．１标本的采集和处理
２００３至２００９年收集不食、无力、步足颤抖的患病中华绒螯蟹，采集病蟹的池塘分布在江苏省２２个地区，分别是南京、高淳、句容、六合、苏州、昆山、宜兴、扬州、金坛、溧阳、镇江、兴化、中港、公民、金湖、高邮、泗洪、洪泽、宝应、宿迁、一场和天平，其中宝应县的病蟹采自３月和１１月，其他２１个地区的病蟹均在７、８月采集。采集的病蟹用保温盒低温运送到实验室。
１．２中华绒螯蟹颤抖病螺原体的分离和形态观察
垂死的中华绒螯蟹用７５％乙醇进行体外消毒，用高压灭菌的解剖器皿进行解剖。取约０．２ ｇ的腹肌放在无菌称量纸上剪碎，碎屑转移到２ ｍＬ灭菌ＰＢＳ缓冲液中，室温静置１ ｈ后在超净台内用孔径０．２２ μｍ的滤器过滤，得到中华绒螯蟹肌肉组织匀浆液。取组织匀浆液５０ μＬ接种至１ ｍＬ Ｒ２液体培养基中［５］，３０ ℃恒温培养箱培养，逐日观察培养基颜色变化。当培养至对数生长期时，取螺原体菌液０．０１ ｍＬ置Ｎｉｋｏｎ相差显微镜下观察螺原体的螺旋形态及运动特性。同时取少许对数期螺原体菌液与４％戊二醛溶液等体积混合均匀，４ ℃固定２ ｈ，吸混合液少许置Ｆｏｒｍｖａｒ包被的铜网上，１ ｍｉｎ后用滤纸吸干，随即加上一滴２％磷钨酸钠溶液作用３０ ｓ左右，然后用滤纸吸干。负染后的铜网于干燥器内干燥后用日立Ｈ－６００型透射电镜观察并拍摄螺原体的形态。
１．３中华绒螯蟹颤抖病螺原体基因组ＤＮＡ的提取
取病蟹肢肌０．２ ｇ，在低温石蜡板上切碎，转移至１．５ ｍＬ 离心管中，加入５％ Ｃｈｅｌｅｘ１００螯合树脂混匀液１５０～２００ μＬ，震荡混匀后加入５ μＬ ２０ ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ溶液，漩涡器振荡１０ ｓ，使充分接触后，５６ ℃，恒温金属浴消化１．５～２．０ ｈ；待裂解液由混浊变澄清后取出置漩涡器充分振荡１０ ｓ，９９ ℃恒温金属浴孵育８ ｍｉｎ（不宜过长，防止ＤＮＡ高温下变性）；取出漩涡振荡器充分振荡数秒，１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心４ ｍｉｎ，取上清液（含有模板ＤＮＡ）于另一支灭菌１．５ ｍＬ离心管中，－２０ ℃保存。
１．４中华绒螯蟹颤抖病螺原体１６ Ｓ－２３ Ｓ ｒＲＮＡ基因间隔区序列的扩增
使用引物扩增中华绒螯蟹颤抖病螺原体的１６ Ｓ ｒＲＮＡ基因、２３ Ｓ ｒＲＮＡ基因和１６ Ｓ－２３ Ｓ ｒＲＮＡ基因间隔区序列，引物序列为１６Ｆ２：ＧＧＴＧＣＡＴＧＧＴ
ＴＧＴＣＧＴＣＡＧ和２３Ｒ１： ＴＴＣＧＣＴＣＧＣＣＧＣＴＡＣＴＡＡ
Ｇ［４］。模板为从３月及１１月在宝应县采集的２只病蟹及７、８月在其他地区采集到的４２只病蟹中提取到的螺原体基因组ＤＮＡ。ＰＣＲ反应体系为２５ μＬ，包括２．５ μＬ １０× ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ， ２ μＬ ２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ， ２ μＬ ２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２， ０．０１ μｍｏｌ／Ｌ引物各１ μＬ， ０．３ Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（Ｐｒｏｍｅｇａ）， １５ ｎｇ ＤＮＡ模板。ＰＣＲ反应程序为９６ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性５０ ｓ，５６ ℃退火４５ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３０个循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增产物经１％琼脂糖凝胶电泳检测，由南京金斯瑞生物工程技术公司测序部测序，测得的序列均利用ＤＮＡ Ｓｔａｒ ６．０软件包进行拼接校对，校对过的序列上传ＮＣＢＩ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）进行ＢＬＡＳＴ同源性比对。
２结果
２．１病蟹螺原体的形态
收集到的垂死病蟹肌肉组织中均能分离到螺原体，在相差显微镜下可观察到螺原体的螺旋运动性，其运动速度因生长阶段不同而有所差异，一般对数生长期运动性最为强烈，除最常见的螺旋式运动外，还可见屈伸式、折叠式等多种运动形式。在透射电子显微镜下观察，不仅可以清楚地看到病原体的螺旋形形态，还能看到其没有细胞壁结构（图１）。光电镜观察结果与Ｓ． ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｉｓ菌株完全一致。
２．２病蟹螺原体１６ Ｓ－２３ Ｓ ｒＲＮＡ基因间隔区序列
２２个不同样地病蟹螺原体经１６Ｆ２／２３Ｒ１引物对ＰＣＲ扩增后均能得到清晰明亮的条带，且条带大小与预期相符（图２）。４４只病蟹的螺原体ＰＣＲ扩增产物序列经拼接和校对后，长度均为１ ０２７ ｂｐ，包括３１０ ｂｐ １６ Ｓ－２３ Ｓ ｒＲＮＡ基因间隔区序列及其两端的４７５ ｂｐ １６ Ｓ ｒＲＮＡ基因序列和２４２ ｂｐ ２３ Ｓ ｒＲＮＡ基因序列。４４只病蟹的螺原体的１６ Ｓ－２３ Ｓ ｒＲＮＡ基因间隔区序列碱基组成完全相同，选取其中一个序列上传ＮＣＢＩ经ＢＬＡＳＴＮ同源比对后发现其与已报道的中华绒鳌蟹螺原体序列（ＤＱ９１７７５３）［４］相似性为１００％。
３讨论
螺原体是原核细胞生物中最小的一类，能通过０．２２ μｍ滤膜，无细胞壁，做螺旋运动，在对数生长期呈螺旋外形，在分类学上属于细菌域（Ｂａｃｔｅｒｉａ）厚壁菌门（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）柔膜菌纲（Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）虫原体目（Ｅｎｔｏｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）螺原体科（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ）螺原体属（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ），是２０世纪７０年代发现的一类主要寄生于陆生植物和昆虫的微生物［６，７］，少数种类能引起陆生经济植物和昆虫的病害［８，９］。自中华绒螯蟹颤抖病螺原体Ｓ． ｅｒｉｏｃｈｅｉｒｉｓ被发现和进一步证实后，在患重大流行病的克氏原螯虾［１０］、淡水南美白对虾［４］等水产动物体内以及它们的生存环境底泥中［１１］也发现了螺原体，此外，Ｎｕｎａｎ等［１２，１３］在海水养殖南美白对虾中也发现了螺原体类病原微生物。
１６ Ｓ－２３ Ｓ ｒＲＮＡ基因间隔区是位于原核生物ｒＲＮＡ操纵子上的一个无功能区，受到很小的选择压力，其长度和序列在细菌种间呈高度变化，它的进化速度是１６ Ｓ ｒＲＮＡ基因的１０倍，这使得它更适合于鉴别和分析一些亲缘关系密切的细菌种类。研究表明１６ Ｓ－２３ Ｓ ｒＲＮＡ基因间隔区序列不仅可以成功鉴定一些螺原体的种［１４］，还可以分析近缘菌株间的姻亲关系［１５］。尽管本研究分析的４４只病蟹来源于江苏省的不同地区及不同季节，其螺原体１６ Ｓ－２３ Ｓ ｒＲＮＡ基因间隔区序列没有一个碱基差异。由此可见，中华绒螯蟹颤抖病螺原体是一种广泛分布于江苏省养殖中华绒螯蟹体内的病原微生物，该病原微生物具有较强的致病性，它们不仅在７月底８月初高温季节引起中华绒螯蟹发病和暴发性死亡，还能在３月和１１月等低温季节引起部分中华绒螯蟹的发病和死亡。然而，该病原是否也在其他中华绒螯蟹养殖地区如上海、安徽、江西、湖北、辽宁、天津等分布有待进一步研究。
参考文献：
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