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摘 要 建立了一种快速、简便的基于壳层隔绝纳米粒子和在线裂解捕集技术的血液氰化物表面增强拉曼光谱（SERS）检测方法。构建了新型在线裂解吹扫捕集装置，通过浓H2SO4酸化，将全血中结合态氰化物裂解，并转化为挥发性的HCN气体，经N2吹扫至碱液中形成NaCN，实现了中毒血液中氰化物的高效裂解与捕集； 在强碱性条件下，以壳层隔绝金纳米粒子为基底，极大地削弱了氰化物的溶金效应，使得检测信号稳定，存在时间由普通金纳米粒子的5 min提高至1 h； 方法检出限达10 μg/L，线性范围为100～2000 μg/L。将此方法应用于氰化物染毒大鼠及真实氰化物中毒患者全血的快速检测，为氰化物中毒快速检测提供了一种灵敏、特异、可靠的新方法。
关键词 壳层隔绝纳米粒子； 氰化物； 中毒血液样品； 在线裂解吹扫捕集； 表面增强拉曼光谱
1 引 言
氰化物是一种廉价、速杀的血液性毒剂，中毒事件屡有发生[1～3]。氰化物吸收入体后，氰根可迅速与细胞线粒体内高铁细胞色素氧化酶结合，生成氰化高铁细胞色素氧化酶，使其失去传递氧的作用，造成组织缺氧，最终导致机体窒息，甚至死亡[4]。氰化物属于剧毒物质，人体口服途径的急性中毒致死剂量为0.48～3.37 mg/kg体重（氰根）[5]，在数分钟内即出现急性中毒症状。因此，尽早发现、及时干预是有效救治的基本原则，而血液氰化物含量的现场快速检测是指导中毒救治的首要前提。
目前，针对氰化物中毒生物样本常用的检测方法包括目视比色法[6，7]、分光光度法[8]、气相色谱法[9]、离子色谱法[10]及色谱质谱法[11]等。其中，目视比色法和分光光度法等多利用氰化物和顯色物质间的定量反应，灵敏度在0.01～ 1 mg/L水平，特异性较差； 而色谱（质谱）等方法中，氰化物（氰根或氧化物）自身属于高极性小分子物质，除需衍生化或选择特殊类型的色谱柱外，中毒生物样品前处理过程复杂、耗时，使得上述方法仅适用于实验室检测。表面增强拉曼光谱（Surfaceenhanced Raman spectroscopy， SERS）技术具有灵敏度高、指纹谱准确识别、检测速度快、适用于现场快速检测等优点[12～16]，本课题组前期亦发展了芥子气[17]、光气[18]、百草枯[19]等化学毒剂毒物的SERS现场快速检测方法。SERS技术在氰化物中毒现场检测方面具有较大潜力。
本研究基于有孔壳层隔绝纳米粒子（Pinhole shellisolated nanoparticles，pinSHINs），结合便携式拉曼光谱，建立了一种血液氰化物快速SERS检测新方法。PinSHINs极薄的有孔SiO2壳层能够有效保护金核，极大地削弱了Au-CN配位形成可溶性复合物Au（CN）所导致的“溶金”效应，使其具有比普通金纳米粒子（AuNPs）更优越的稳定性[20，21]。
但是考虑到与血细胞中细胞色素氧化酶结合的氰化物难以被直接检测，常用强酸使结合态氰化物释放产生HCN，再进行衍生化及分光光度法测定[8，22，23]，较为复杂、耗时。本研究构建了血液中氰化物的在线裂解吹扫捕集方法，以浓H2SO4酸化全血样品，将结合态氰化物裂解，并转化为挥发性的HCN气体，经N2吹扫至碱液中形成NaCN，继而直接对碱液进行SERS检测，其灵敏度高、特异性强，操作方便快速，检出限达10 μg/L。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
所有SERS光谱于iRaman型便携式拉曼光谱仪（美国 B&W TEK公司）上测定（激光波长785 nm，分辨率4.5 cm）。紫外可见吸收光谱（UVVis）于Cary 300型紫外可见分光光度计上（美国Varian公司）获得。
NaCN（纯度为99%，申领于军事医学科学院毒物药物研究所毒剂库）； Na2SiO3（美国Sigma公司）； NaOH（国药集团北京化学试剂公司）； 3氨丙基三乙氧基硅烷（ATPMS，美国Alfa Aesar公司）； 消泡剂为本课题组自制（主要成分为脂肪酸酯）； 真空封泥（酒泉祁天特种油品有限公司）； 15 mL离心管及96孔酶标板（美国Corning公司）； 肝素化采血管（江苏宇力医疗器械有限公司）。除特殊说明外，所有化学试剂均为分析纯或以上。所有溶液均由超纯水（MilliQ A10，美国Millipore公司）配制。雄性SD大鼠（SPF级180～200 g，北京维通利华动物实验公司，许可证号：SCXK（京）20120001），饲养于军事医学科学院实验动物中心SPF级动物房。氰化物中毒患者全血样品由军事医学科学院附属医院中毒救治科提供。
2.2 实验方法
2.2.1 壳层隔绝金纳米粒子的制备 首先用Frens柠檬酸钠还原法[24]合成粒径约为55 nm的金纳米粒子（AuNPs），向制备好的55 nm AuNPs中加入1 mmol/L APTMS溶液，搅拌15 min，再加入Na2SiO3溶液 （0.54%， w/w） 并搅拌3 min，使AuNPs表面包覆生成SiO2壳层。控制Na2SiO3溶液的pH>11，即可生成1～2 nm厚的有孔SiO2壳层[25]。
2.2.2 NaCN标准溶液的配制 准确称量NaCN 10.00 mg，用0.01 mol/L NaOH溶液溶解并定容至10 mL， 得1.00 g/L NaCN对照品溶液，于4℃保存。使用时，以0.01 mol/L NaOH溶液稀释得到浓度为0.005、0.05、0.5、5和50 mg/L的工作溶液。
2.2.3 血液氰化物在线裂解吹扫捕集装置的构建 血液氰化物在线裂解吹扫捕集装置分为挥发装置（A）、吸收装置（B）和尾气吸收装置（C）三部分（图1），3只15 mL离心管经相同孔径导管相连，导管连接处均经真空泥密封，气密性检测表明装置无漏气。在装置（A）中加入浓H2SO4，使结合态氰化物酸化裂解，生成HCN气体，经氮气吹扫至装置（B），被其中的NaOH溶液充分吸收，形成NaCN，对吸收液进行SERS检测； 装置（C）连有一段活性炭管，以吸收多余的尾气。在优化条件下，装置（A）中添加1 mL待测样品、4 mL 12 mol/L H2SO4溶液和200 μL消泡剂（快速消除吹扫血样时产生的大量泡沫，防止堵塞管路），装置（B）和（C）中均加入1 mL 0.1 mol/L NaOH溶液。
2.2.4 SERS检测 取1 mL pinSHINs，5000 r/min离心5 min，去除上清液，与200 μL吸收液混合，移入96孔酶标板，进行SERS检测。便携式拉曼光谱仪参数为：激光功率90 mW，积分时间10 s。
2.2.5 NaCN染毒动物实验 依据口服常用染毒剂量[26]及预实验数据，按3 mg/kg（50%半数致死剂量LD50）的剂量向插管SD雄性大鼠灌胃染毒NaCN生理盐水溶液，在注射之前抽取血液，设为“零”时间点。在注射后5 min，15 min， 30 min， 60 min， 2 h， 4 h和6 h各抽取血液500 μL于肝素化采血管中，按2.2.3和2.2.4節进行检测。
3 结果与讨论
3.1 PinSHINs的表征
以 UVVis 吸收光谱、TEM及 HRTEM 对 pinSHINs 进行表征（图2）。pinSHINs的最大紫外吸收峰位于536 nm处，半峰宽较窄，说明粒径分布较均匀，计算得到的粒径约为60 nm[27]； TEM表征下pinSHINs的粒径约为55 nm； HRTEM表征下其Au核外包裹了约为1 nm的SiO2 壳层，在此厚度下，壳层中分布有大量孔隙[25]，氰根可通过孔隙与Au核表面直接接触[21]，保持了对氰根响应信号的良好增强性能。
3.2 血液氰化物在线裂解吹扫捕集与SERS检测
目前已报道的氰化物SERS检测方法中，多存在“溶金”效应，检测信号仅可稳定存在5 min[28]； 且目前尚无血液中氰化物的SERS检测报道。其难点在于，血液中的氰化物大部分与血细胞内细胞色素氧化酶生成结合态[29]，难以直接检测。构建的在线裂解吹扫捕集装置，以浓H2SO4酸化样品，可将细胞中结合态氰化物裂解并转化为挥发性的HCN气体，经N2吹扫至碱液中，形成NaCN，无需任何复杂反应，后续采用pinSHINs为基底，可对碱性吸收液直接进行SERS检测，即可得到灵敏且稳定的氰根指纹谱信号（图3A）。
经优化后确定，浓H2SO4浓度12 mol/L、NaOH吸收液浓度0.1 mol/L、N2吹扫时间20 min为结合态氰化物裂解捕集最佳条件。将本方法与本课题组已报道的氰化物在线氢化产气吹扫方法进行比较[19]，捕集效率提高了10倍（约为77%～81%）（图3B）。
不同浓度NaCN（100～2000 μg/L）染毒全血实验结果表明，2135 cm处SERS峰强度与NaCN浓度存在良好线性响应（y=17x+4393； R2=0.997）（图4A），定量下限低于临床上发生中毒反应时血液氰化物浓度（200 μg/L）[9]。低、中、高浓度（200、1000和1500 μg/L）下，本方法相对回收率为91%、106%和108%，RSD值为4.9%、7.6%和4.8%，表明方法可靠性和稳定性较好。本方法的检出限为10 μg/L，低于人血液氰化物致死浓度（LD100）1000 μg/L[27]两个数量级，即可检测到0.01 LD100，适合于检测各种程度的氰化物中毒血液样品。
常用的AuNPs易与氰化物发生“溶金”效应，且在强碱性条件下会过度团聚，导致检测信号迅速衰减，而pinSHINs由于其外层包裹的SiO2壳层，有效削弱了“溶金”效应，且能耐受较宽的pH范围，因此稳定性得到了有效改善，SERS检测信号1 h后依然可保持80%以上，如图4B所示。5个批次pinSHINs的稳定性采用低、中、高（200、1000和1500 μg/L）3个浓度NaCN加标全血样品进行评估，氰根信号强度的相对标准偏差（RSD）分别为 6.2%、8.1%和7.7%，表明制备的pinSHINs具有良好的重复性。
3.3 染毒大鼠全血及临床样品氰化物浓度的检测应用实例
利用本方法检测了50% LD50的NaCN灌胃染毒大鼠不同时间点的全血样品中氰化物浓度。如图5A所示， NaCN灌胃10 min后，全血氰化物浓度迅速增加至最大值（2613 μg/L），血液中氰化物半衰期为56 min，与文献＼[24＼]报道基本相符； 10～30 min氰化物在体内的代谢迅速下降； 30～100 min氰化物代谢缓慢降低； 6 h后，氰化物浓度趋于本底值。未染毒大鼠全血中检测到少量内源性氰化物（经浓缩富集估算约30 μg/L），可通过随行标准曲线排除其干扰。
将本方法用于临床快速筛查氰化物中毒。分析了3份氰化物中毒患者全血样品，一份为口服KAl（CN）4药片39 h后的采集血样（1#），另两份为注射网购含氰化钾或氯化琥珀胆碱的“捕狗药”后的采集血样（2#，3#），患者送医时均深度昏迷，多脏器功能损伤，严重者呼吸心跳已经停止。按照本方法进行测定，1#和2#测得氰化物的浓度分别为910和530 μg/L，3#未检出氰化物（考虑为氯化琥珀胆碱）（图5B）。 为临床及时救治提供了参考。
4 结 论
基于壳层隔绝纳米粒子的强碱耐受性和能够有效克服“溶金”效应的优势，以及所构建的在线裂解吹扫捕集装置，建立了一种氰化物快速检测SERS新方法，实现中毒全血结合态氰化物的有效解离、挥发及吸收，达到了快速、高灵敏定量检测中毒血液中氰化物的目的。本方法已应用于氰化物灌胃染毒大鼠及临床氰化物中毒血液样本检测，且所有SERS检测均于便携式拉曼光谱仪上完成，显示出在氰化物中毒现场快速检测良好的应用前景。预期除血液样品外，本方法亦可适用于食品、环境复杂基质中的氰化物检测。
References
1 Barillo D J， Goode R， Esch V. J. Burn Care Rehabil.， 1994， 15（1）： 46-57
2 Baud F J， Barriot P， Toffis V， Riou B， Vicaut E， Lecarpentier Y， Bourdon R， Astier A， Bismuth C. N. Engl. J. Med.， 1991， 325（25）： 1761-1766
3 Gleadow R M. Plant Biol.， 2014， 65（65）： 155-185
4 Conn E E. Effects of Poisonous Plants on Livestock. New York： Academic Press， 1978： 301-310
5 Joint F A O. World Health Organization， WHO Expert Committee on Food Additives. Safety Evaluation of Certain Food Additives and Contaminants： Prepared by the Seventy Fourth Meeting of the Joint FAO＼[R/OL＼]. 2012： 299＼[2011119＼]
6 Chaudhary M T， Sarwar M， Tahir A M， Tahir M A， Mustafa G， Wattoo S A， Imran M， Subhani A. Australian J. Forensic Sci.， 2015， 48（1）： 42-49
7 XU Hong， SONG YinSheng， CAO WenTing， ZHANG ChunLing. Chin J Health Lab Tec， 2015， 25（11）： 1705-1707
徐 虹， 宋寅生， 曹文婷， 張春玲. 中国卫生检验杂志， 2015， 25（11）： 1705-1707
8 Lundquist P， Srbo B. Clin. Chem.， 1989， 35（4）： 617-619
9 Calafat A M. Stanfill S B. J. Chromatogr. B， 2002， 772（1）： 131-137
10 Chinaka S， Takayama N， Michigami Y， Ueda K. J. Chromatogr. B， 1998， 713（2）： 353-359
11 Lacroix C， Saussereau E， Boulanger F， Goullé J P. J. Anal. Toxicol.， 2011， 35（3）： 143-147
12 Zhu Q X， Cao Y B， Cao Y Y， Chai Y F， Lu F. Anal. Bioanal.Chem.， 2014， 406（7）： 1877-1884
13 LUO ZhiXun， FANG Yan. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2006， 26（2）： 358-364
骆智训， 方 炎. 光谱学与光谱分析， 2006， 26（2）： 358-364
14 LIU JiangMei， LIU WenHan， TENG YuanJie， YUAN RongHui. Chin. J. Lumin， 2015， 36（12）： 1477-1484
刘江美， 刘文涵， 滕渊洁， 袁荣辉. 发光学报， 2015， 36（12）： 1477-1484
15 ZUO Qi， CHEN Yao， SHI CaiXia， CHEN ZengPing. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（11）： 1656-1663
左 奇， 陈 瑶， 石彩霞， 陈增萍. 分析化学， 2015， 43（11）： 1656-1663
16 Shi Y E， Wang W S， Zhan J H. Nano Res.， 2016， 9（8）： 2487-2497
17 GAO Jing， WU JianFeng， GAO HaiYue， GUO Lei， XIE JianWei. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（10）： 1465-1470
高 敬， 吴剑峰， 高海月， 郭 磊， 谢剑炜. 分析化学， 2014， 42（10）： 1465-1470
18 Gao H Y， Wu J F， Zhu Y J， Guo L， Xie J W. J. Raman. Spectrosc.， 2015， 47（2）： 233-239
19 Zhu Y J， Wu J F， Gao H Y， Liu G K， Tian Z Q， Feng J L， Guo L， Xie J W. RSC Adv.， 2016， 6（65）： 59919-59926
20 Li J F， Huang Y F， Ding Y， Yang Z L， Li S B， Zhou X S， Fan F R， Zhang W， Zhou Z Y， Ren B. Nature， 2010， 464（7287）： 392-395
21 Gao J， Guo L， Wu J F， Feng J L， Wang S M， Lai F L， Xie J W， Tian Z Q. J. Raman. Spectrosc.， 2014， 45（8）： 619-626
22 Lundquist P， Rosling H， Srbo B. Clin. Chem.， 1985， 31（4）： 591-595
23 Hughes C， Lehner F， Dirikolu L， Harkins D， Boyles J， McDowell K， Tobin T， Crutchfield J， Sebastian M， Harrison L. Toxicol. Mechanisms Method， 2008， 13（2）： 129-138
24 Frens G. Nature， 1973， 241（105）： 20-22
25 Li J F， Tian X D， Li S B， Anema J R， Yang Z L， Ding Y， Wu Y F， Zeng Y M， Chen Q Z， Ren B. Nat. Protoc.， 2013， 8（1）： 52-65
26 Sousa A B， Manzano H， Sotoblanco B， Górniak S L. Arch. Toxicol.， 2003， 77（6）： 330-334
27 Haiss W， Thanh N T K， Aveyard J， Fernig D G. Anal. Chem.， 2007， 79（11）： 4215-4221
28 Senapati D， Dasary S S R， Signh A K， Senapati T， Yu H， Ray P C. Chem. Eur J.， 2001， 17（30）： 8445-8451
29 Vesey C J， Wilson J. J. Pharm. Pharmac.， 1978， 30（1）： 20-26