[摘要] 目的 探讨高血压大鼠外周血液白细胞线粒体DNA拷贝数和端粒长度的变化，以及二者之间的相关性。 方法 SD大鼠40只，随机分为3组：高血压组（15只）、假手术组（15只）和空白对照组（10只）。高血压组采用双侧肾动脉后支结扎，术后予以8% NaCl饲料的方法构建高血压大鼠模型。选取术后4个月为观察终点，利用鼠尾血压计测量血压，随后行眶下静脉丛取血，提取血液基因组DNA，Real-time PCR法测量相对线粒体DNA拷贝数和端粒长度。 结果 术后4个月时与假手术组比较，高血压组大鼠血压显著升高[（178.36±10.21）比（128.47±8.74）mmHg，P < 0.01]，线粒体DNA拷贝数显著增加[（1.49±0.43）比（1.09±0.51），P < 0.05]，端粒长度显著缩短[（0.83±0.23）比（1.04±0.29），P < 0.05]。高血压组大鼠线粒体DNA拷贝数与端粒长度变化呈负相关（r= -0.589，P < 0.05）。 结论 高血压大鼠模型可出现外周血白细胞线粒体DNA拷贝数升高和端粒长度缩短，且二者呈负相关。
[关键词] 高血压；mtDNA拷贝数；端粒；大鼠
[中图分类号] R544.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）11（a）-0033-04
高血压是心血管疾病的主要危险因素之一，在我国成人中，高血压发病率可高达29.6%，已成为我国一个严重的公众健康负担[1]，其主要危害在于随患病时间的延长，可引起动脉粥样硬化、冠心病、脑卒中等多种年龄相关疾病[2-3]。近期有研究显示，线粒体功能障碍和端粒缩短不仅是细胞老化过程中的两个关键进程，二者之间还可能存在着相互作用[4]，但是目前尚无研究涉及高血压疾病中线粒体和端粒功能之间的可能联系。因此，本研究旨在通过利用线粒体拷贝数和端粒长度的变化，来探索高血压大鼠模型中线粒体和端粒功能之间的联系，或可为高血压继发疾病的发病机制探索及早期治疗提供更多的基础研究支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
成年雄性SD大鼠40只，7～8周龄，体重220～250 g（军事医学科学院动物实验中心，合格证号0033432）。血液基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），UltraSYBR Mixture With ROXⅡ（北京康为世纪生物科技有限公司），Real-time PCR引物（安徽通用生物系统有限公司），Real-time PCR仪（Step One Plus，美国ABI公司），鼠尾血压计（美国IITC公司），NanoDrop 2000（美国Thermo Fisher Scientific公司）。实验方案经武警后勤学院附属医院伦理委员会审查通过。
1.2 高血压模型建立
将40只大鼠随机分为高血壓组（15只）、假手术组（15只）和空白对照组（10只）。高血压组大鼠经1%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉后，按Eldawoody等[5]的方法，结扎双侧肾动脉后支，术后1周给予含8% NaCl饲料，正常饮水。假手术组麻醉后仅暴露双侧肾动脉15 min，术后正常饮食。空白对照组不进行任何操作。
1.3 高血压模型评估
采用标准尾部测压法，术后1个月时进行血压测量以判断高血压组是否出现血压升高，术后4个月取材前再次测量血压予以确认，两次测量均表现为血压升高则说明该高血压模型稳定可靠。
1.4 血液标本采集
于模型建成后，利用直径0.9 mm毛细玻璃管进行眶下静脉丛取血1.5 mL。
1.5 端粒长度及mtDNA拷贝数测定
按照说明书提取血液基因组DNA。参考文献[6-7]设计端粒（Tel）、线粒体单拷贝基因COXⅠ和内参基因36B4的引物，引物序列及终浓度见表1。PCR反应体系为25 μL，包括2×UltraSYBR Mixture 12.5 μL，基因组DNA25 ng，以及相应体积的引物和灭菌双蒸水，每个样品设3个重复孔。目的基因与内参基因的PCR反应条件一致，采用两步法：95℃ 10 min预变性后，进行95℃ 15 s、60℃ 1 min共40个循环，95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 15 s、60℃ 15 s行融解曲线分析。应用相对定量法计算端粒长度和线粒体的相对拷贝数，即得出各样本不同基因的CT值后，首先计算出目的基因与单拷贝基因CT值的比值（T/S）：[2Ct（tel）/2Ct（36B4）]-1=2-ΔCt，再用各样本的T/S值除以对照组T/S的平均值，得到相对T/S值：2-ΔCt/2-ΔCt（对照平均值）=2-ΔΔCt。当相对T/S=1时，代表实验组的目的基因表达与对照组完全相同，当相对T/S>1时，说明实验组目的基因表达更多，反之说明目的基因表达更少。
1.6 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；相关性分析采用Pearson相关 性检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠存活情况
高血压组1只大鼠因术后局部感染导致粘连性肠梗阻，于术后10 d死亡，其余均存活至观察终点。
2.2 各组大鼠血压比较
术前三组血压差异无统计学意义（F=1.340，P=0.275）。术后1个月和术后4个月时，高血压组血压均显著升高（均P < 0.01），假手术组与空白对照组比较，血压差异均无统计学意义（均P > 0.05）。
2.3 两组端粒长度及mtDNA拷贝数比较
术后4个月时，高血压组与假手术组比较，mtDNA拷贝数差异有统计学意义[（1.49±0.43）比（1.09±0.51），P < 0.05]，端粒长度差异有统计学意义[（0.83±0.23）比（1.04±0.29），P < 0.05]。
3 讨论
线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是线粒体内相对独立的环状基因组DNA，其在基因组中的个数称为mtDNA拷贝数。线粒体DNA由于缺少组蛋白的保护，极易受到炎症、氧化应激、激素水平变化等因素的损伤，造成线粒体基因突变，从而出现功能障碍，但线粒体内DNA的修复系统效率很低，机体维持线粒体基因及功能完整性的主要机制是诱导mtDNA拷贝数的增加[8]。此前已有众多研究显示，白细胞mtDNA拷贝数不仅可以反映线粒体的功能与生物合成，还可以作为一种替代性标志物，提示与线粒体功能障碍相关的多种代谢性疾病，例如胰岛素抵抗和糖调节异常[9]、非酒精性脂肪肝病[10]和高同型半胱氨酸血症[11]，但其在高血压等血管疾病中的变化尚存在争议。Chen等[12]发现，在高血压大鼠心肌细胞内mtDNA拷贝数显著升高，可能是因为氧化应激可通过氧化线粒体通透性转换孔（MPTP）上的二硫键部位和吡啶核苷酸部位，使MPTP持续开放，并降低线粒体膜电位，从而激活线粒体凋亡通路[13]，使线粒体拷贝数发生了代偿性增加。但也有学者得出了相反的结论，Kim等[4]发现，在老年女性中，高血压组患者表现出减少的外周血白细胞mtDNA拷贝数，可能是由于该研究中受访者患病时间较短，mtDNA拷贝数尚未发生明显的代偿性增加。本实验发现，高血压4个月后，线粒体拷贝数显著升高，提示高血压造成了线粒体功能障碍并使拷贝数发生了代偿性增高。这表明线粒体功能的损伤与高血压的发展密切相关，可能是由于长期高血压造成的慢性氧化应激刺激触发了呼吸核因子与线粒体转录因子的表达，促进线粒体增殖从而降低损伤mtDNA所占比例，以代偿呼吸功能的下降，故mtDNA拷贝数发生了代偿性升高[14]。
端粒是真核细胞染色体末端的一段非编码重复序列，细胞每次分裂端粒都会缩短30～150碱基，当缩短到一定程度时，细胞则会进入衰老阶段并发生凋亡[15]。端粒缩短程度代表了衰老的水平，且与多种心血管疾病的发生有关，但其在高血压疾病中的变化目前尚有争议。Bhupatiraju等[16]研究发现，印度人群中高血压患者端粒长度与健康人群相比明显缩短，且端粒长度与年龄、舒张压、收缩压均呈负相关。Farrag等[17]也发现，高血压患者外周血液白细胞端粒长度与健康人群相比显著缩短，而且与BMI指数无关。这可能是由于高血压时血管表面切应力改变，可诱导血管内皮细胞功能失调，引起一氧化氮合成受损，加重氧化应激反应[18]，造成了端粒DNA单链断裂，从而在DNA复制时引发错配与重排，使端粒缩短[19]。然而Morgan等[20]提出，高血压的发生发展与端粒长度的缩短無关，这可能由于高血压作为一种慢性疾病，其对机体的影响是漫长而缓慢的，该研究进行时纳入标准中没有包括患病年限，且研究样本例数（55例患者）较少，导致了高血压与端粒缩短的相关性尚未显现出来。本实验中，高血压模型大鼠端粒显著缩短，表明端粒缩短与高血压密切相关。
本实验还发现，mtDNA拷贝数与端粒长度呈负相关，表明线粒体和端粒不仅与高血压的发展相关，两者之间还会发生相互影响。这与Tyrka等[21]在研究童年经历过逆境或曾患有精神疾病的人群时发现的结果相一致。可能原因如下：线粒体的环状DNA共编码37个基因，包括呼吸复合物亚基和一些线粒体tRNA和rRNA[4]，调节线粒体生物基因组和包括细胞呼吸在内的多种功能时，核基因编码的核蛋白表达发挥着重要作用。这些核蛋白包括核转录共激活剂（PGC-1α和PGC-1β）、AMP活化蛋白激酶、哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）等[22]。当对核基因起保护作用的端粒受到氧自由基、炎症因子等攻击时，一方面受损的端粒可诱导p53表达，抑制转录共激活剂PGC的功能，从而造成线粒体功能障碍；另一方面端粒损伤还可直接影响线粒体氧化呼吸链相关蛋白基因的转录与表达，导致线粒体功能障碍[23]。该结果不仅进一步解释了线粒体和端粒与高血压的密切关系，还提示了若以端粒或线粒体为靶点对高血压进行干预时，应同时兼顾二者，或许能发挥更好的效果。
综上所述，本实验通过手术构建的高血压大鼠模型发现，高血压大鼠mtDNA拷贝数显著升高，端粒显著缩短，并认为mtDNA拷贝数增加所代表的线粒体功能障碍与端粒缩短密切相关。这为进一步解释高血压疾病引起年龄相关心脑血管病的发生机制提供了帮助，并为预防高血压引起继发脏器损害提供了潜在治疗靶点。
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（收稿日期：2016-08-02 本文编辑：程 铭）