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[摘要] 探究肉苁蓉低分子糖（LMSC）对RAW264.7小鼠巨噬细胞的激活作用靶点蛋白群及相关作用机制。该研究首先通过测定巨噬细胞吞噬活性以及NO释放量来评价LMSC对RAW264.7巨噬细胞的激活作用。实验结果显示，LMSC在0.25～2 g·L-1给药浓度可显著提高RAW264.7细胞的吞噬活性及NO的释放量，提示具有巨噬细胞激活作用。通过构建LMSC键合的环氧活化琼脂糖固相微球作为亲和介质，捕获RAW264.7细胞裂解液中特异性结合靶标蛋白；对高分辨质谱鉴定获得的LMSC靶标蛋白群进行信号通路富集分析，探讨LMSC巨噬细胞激活作用相关机制。实验共获得Eef2等24个LMSC靶点蛋白，分别涉及Fcγ受体依赖的吞噬、TNF-α NF-κB信号通路、糖酵解/糖原异生以及柠檬酸（TCA）循环和呼吸电子运输过程等10条巨噬细胞激活相关信号通路。以上结果提示LMSC通过作用于多个靶点进而调节细胞吞噬、NF-κB信号通路以及糖代谢途径最终实现对RAW264.7巨噬细胞激活作用。
[关键词] 肉苁蓉； 低分子糖； 巨噬细胞激活； 分子亲和色谱； 靶点识别； 作用机制分析
[Abstract] This study aims to investigate the targets and targets-involved mechanism for the macrophage activation of low molecular weight saccharides from Cistanche deserticola （LMSC）. The phagocytic activity and NO release of RAW264.7 cells were detected， and results showed that LMSC exerts immune activation effect by significantly increasing the phagocytic activity and NO release. LMSC-conjugated epoxy-activated sepharose beads were prepared as affinity reagent to capture the target proteins. Twenty-four proteins such as Eef2 were identified by LC-MS/MS analysis. Pathway eichment analysis showed LMSC activated RAW264.7 cells by regulating Fcgamma receptor dependent phagocytosis， TNF-alpha NF-κB signaling pathway， glycolysis/gluconeogenesis and the citric acid cycle and respiratory electron transport pathway.
[Key words] Cistanche deserticola； low molecular weight saccharides； macrophage activation； molecular affinity chromatography； target identification； mechanism analysis
肉蓯蓉Cistanches Herba是我国著名传统补益中药，具有补肾阳、益精血、润肠通便[1]之功效，有“沙漠人参”之称。现代分析化学研究表明肉苁蓉中含有多种糖类成分，包括以果糖等为主的单糖化合物、蔗糖等寡糖化合物以及含ACDP-2等多糖，是肉苁蓉发挥免疫调节、通便等作用的显效物质[2-5]。肉苁蓉多糖被广泛报道为一类具有免疫调节作用的活性成分，低分子糖类（LMSC）如寡糖和单糖却鲜为研究。本课题组一项对肉苁蓉中主要活性部位进行巨噬细胞激活作用的研究发现，低分子糖是一类具有巨噬细胞激活作用的活性成分，但其免疫激活作用靶点及作用机制目前仍不明确。
分子亲和色谱是一种通过固定相特异性结合目标分子从而实现分离纯化目的色谱方法[6]。该方法具有高亲和力与高专一性，尤其适用于目标产物浓度极低的有机复杂体系[7]，近年来逐步发展成为天然药物靶标识别的有力工具。本研究利用基于分子亲和色谱法的小分子靶标蛋白捕获技术识别并鉴定具有巨噬细胞激活作用的LMSC靶点蛋白群。通过生物信息学分析，获得靶标群的信号调节通路信息，以此探讨LMSC的免疫调节活性及相关机制。
1 材料
1.1 细胞 小鼠巨噬细胞系RAW264.7购自中国医学科学院细胞中心。
1.2 药物与试剂 胎牛血清（FBS）购自德国PAN Biotech公司；抗生素、DMEM高糖培养基与6×蛋白上样缓冲液均购自中科迈晨科技有限公司。肉苁蓉低分子糖由本课题组自制，经HPLC法测定主要含有甘露醇（16.53%）、蔗糖（8.34%）、果糖（25.38%）、葡萄糖（7.75%）等单体成分。大肠杆菌脂多糖（lipopolysaccharide from Escherichia coli O55：B5，LPS）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）与0.33%中性红溶液均购自美国Sigma-Aldrich公司。一氧化氮（NO）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。环氧活化琼脂糖凝胶（Epoxy-activated Sepharose6B）购自瑞典GE healthcare公司。快速银染试剂盒购自碧云天生物技术研究所。质谱用甲酸和乙腈均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。其余试剂均为国产分析纯。
1.3 仪器 CO2细胞培养箱（SANYO，日本）；CIX100显微镜（Olympus Corporation，日本）；5424R离心机（Eppendorf，德国）；自动纯水机（Millipore，美国）；Suise-Basic酶标仪（TECAN，瑞士）；THZ-C台式恒温振荡器（苏州培英实验设备有限公司）；EASY-nLC-Ⅱ液相色谱仪（Thermo Fisher Scientific，美国）；LTQ-Orbitrap离子阱串联质谱（Thermo Fisher Scientific，美国）；毛细管液相色谱柱（Michrom Bioresources，美国）。
2 方法
2.1 细胞培养及给药 RAW264.7细胞培养于含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM高糖培养基中，并置于含5%CO2的37 ℃饱和湿度恒温培养箱。每2～3 d传代1次，待细胞进入对数生长期时进行实验。将细胞分为空白组、脂多糖组或肉苁蓉低分子糖组。LPS组细胞使用1 mg·L-1LPS溶液处理，作为阳性对照；LMSC组细胞加入不同质量浓度的LMSC溶液（0.25，0.5，1，2 g·L-1；给药前用滤膜过滤）；空白组细胞加入等体积的无血清培养基。
2.2 中性红法测定巨噬细胞吞噬活性 RAW264.7细胞接种于96孔板，过夜培养后更换为无血清培养基或含LPS或不同浓度LMSC的无血清培养基。培养48 h后，细胞更换为0.075%中性红溶液，于37 ℃继续孵育4 h。吸弃上清液，用PBS洗2遍，并使用细胞裂解液（冰醋酸-乙醇1∶1）于4 ℃下裂解细胞，待裂解完全后测定各孔吸光度（A540 nm）。
2.3 细胞上清液中NO释放量检测 RAW264.7细胞接种于48孔板，过夜培养后更换为无血清培养基或含LPS或不同浓度LMSC的无血清培养基。诱导培养24 h后，收集上清液，参照试剂盒说明书测定各孔细胞上清液中NO含量。
2.4 MTT法测定巨噬细胞活力 RAW264.7细胞接种于96孔板，过夜培养后更换为无血清培养基或含LPS或不同浓度LMSC的无血清培养基，继续培养24 h。各孔细胞更换为0.5 g·L-1MTT溶液，37 ℃孵育4 h，随后用二甲基亚砜溶解MTT反应产物，并用酶标仪在570 nm波长处测定各孔吸光度。
2.5 肉苁蓉低分子糖亲和介质的制备 参考文献方法[8]，称取环氧活化琼脂糖树脂0.5 g，于去离子水中溶胀40 min后离心并弃去上清液，重复该过程3次，使凝胶充分溶胀（其体积约为1 mL），备用。分别吸取0.5 mL溶胀的环氧活化琼脂糖凝胶与1 mL LMSC溶液（1 g·mL-1）或等体积溶剂混匀，置于37 ℃恒温摇床上孵育过夜。将空白或偶联LMSC的琼脂糖介质用去离子水清洗数次至上清无色，随后加入1 mL乙醇胺溶液（1 mol·L-1），于37 ℃恒温摇床上封闭2 d。反应结束后依次用双蒸水、NaCl-HAc緩冲液及NaCl-Tris-HCl缓冲液各清洗5次，最后用0.01%NP40洗脱液清洗2次，备用。
2.6 靶点群的富集与识别 向RAW264.7细胞总蛋白提取液（0.5 g·L-1）中分别加入50 μL空白介质或LMSC亲和介质，作为空白对照组及LMSC结合组；另设置同时加入LMSC溶液及LMSC亲和介质的竞争组。各组混合后，于4 ℃下孵育过夜，使LMSC与靶点蛋白充分结合。反应结束后用0.01%NP40洗脱液反复清洗亲和介质6次以洗去亲和介质上残余的游离蛋白。洗涤过的亲和介质加入等体积 2×上样缓冲液，98 ℃变性8 min解离结合蛋白。吸取上清液，进行SDS-PAGE凝胶电泳，随后参照试剂盒说明书进行银染分析。
2.7 LC-MS/MS法鉴定靶点蛋白群 参照文献方法[8]，利用二维纳升级高效液相色谱仪串联线性离子阱质谱法（nano-HPLC-LTQ-Orbitrap/MS）鉴定特异性结合蛋白。具体方法如下：首先利用胰蛋白酶对显色后的差异蛋白条带进行胶内酶解，获得靶点肽段混合物。肽段混合物经0.22 μm微孔滤膜过滤后，吸取10 μL样品溶液加样至毛细管液相色谱柱。色谱条件：流动相0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱条件见表1。质谱条件：电喷雾电压为1.8 kV，正离子模式采集数据，全扫描范围设置为m/z 350～2 000；对15个最强峰进行MS/MS扫描，二级碰撞能量设定为35 V。最后利用SEQUEST检索软件对获得的肽段数据进行检索匹配。
2.8 作用靶点群通路与功能分析 将鉴定得到的靶点蛋白导入Cytoscape 3.5.1软件中，应用ClueGO插件进行KEGG，REACTOME Pathways及Wiki Pathways分析，设定种属为小鼠，P<0.05为显著性阈值，其余采用默认参数。
2.9 统计学分析 所有实验数据均以±s表示。采用GraphPad Prism-6.02 统计软件进行单因素方差分析（ANOVA），以P<0.01作为具有非常显著性差异。
3 结果与讨论
3.1 肉苁蓉低分子糖对RAW264.7细胞吞噬活性的影响 在本课题组另一项对肉苁蓉巨噬细胞激活作用活性组分发现的研究中，LMSC可能是一类具有巨噬细胞激活作用的成分。本实验首先利用中性红法测定RAW264.7小鼠腹腔巨噬细胞体外培养体系经不同给药浓度LMSC刺激后细胞内中性红含量，以此考察LMSC对RAW264.7细胞吞噬活性的影响。与空白对照组相比，阳性对照药LPS刺激细胞48 h可显著增强细胞吞噬活性（P<0.01）；LMSC在0.25～2 g·L-1各给药组均能显著提高RAW264.7细胞的吞噬活性（P<0.01），且呈现剂量依赖特征。以上结果提示，LMSC可能具有激活RAW264.7细胞的作用，见图1。
3.2 肉苁蓉低分子糖对RAW264.7细胞NO释放的影响 NO是一种重要的具有机体免疫调节作用的细胞因子[9]，被广泛报道参与调控RAW264.7细胞激活反应。为进一步考察LMSC对RAW264.7细胞的激活作用，测定了LMSC刺激后细胞上清液中NO的含量。巨噬细胞激活阳性药物LPS组NO释放量显著高于空白对照组（P<0.01），与之相似，0.5，1，2 g·L-13种剂量LMSC给药组中RAW264.7细胞NO释放量均明显高于空白对照组（P<0.01），且呈剂量依赖性，见图2。以上结果表明LMSC具有促进RAW264.7细胞释放NO的效果，证实其巨噬细胞激活作用。
3.3 肉苁蓉低分子糖对RAW264.7细胞活力的影响 细胞毒性作用是制约新药开发与影响药物发挥药效的一项重要因素，为了考察本实验中LMSC所用剂量是否具有潜在的细胞毒性，利用MTT法检测LMSC给药后的RAW264.7细胞活力。LMSC在0.25～2 g·L-1干预RAW264.7细胞24 h后对细胞活力没有显著影响，以上结果提示0.25～2 g·L-1LMSC对RAW264.7没有细胞毒性，见图3。
3.4 肉蓯蓉低分子糖巨噬细胞激活作用靶点群的富集与鉴定 环氧活化琼脂糖凝胶是一种广泛应用于含有羟基或氨基的糖类、蛋白质等多种分子偶联的固相载体。LMSC主要由富含羟基的果糖、甘露醇等成分组成，本研究利用所含的羟基可与环氧活性基团进行反应的特性，将肉苁蓉低分子糖键合到环氧活化琼脂糖凝胶微球表面，构建LMSC亲和介质，见图4A。利用分子亲和色谱技术，将LMSC亲和介质与RAW264.7细胞总蛋白提取液进行孵育，以捕获直接作用靶点蛋白群。对靶点群进行银染色，见图4B，LMSC亲和介质结合组的蛋白条带明显多于未偶联LMSC的空白介质组，而LMSC竞争组由于过量游离LMSC与靶点蛋白竞争性结合，引起亲和介质捕获靶点数目显著降低。随后利用HPLC-MS/MS法对各蛋白条带进行鉴定，共获得Eef2等24个靶点蛋白，提示肉苁蓉低分子糖可能通过以上靶点蛋白联合作用引起巨噬细胞激活。
3.5 肉苁蓉低分子糖巨噬细胞激活作用靶点群相关的作用机制分析 为了探究肉苁蓉低分子糖靶点蛋白引起RAW264.7巨噬细胞激活的作用机制，本研究应用KEGG，REACTOME和Wiki信号通路数据库对LMSC靶蛋白群所涉及的生物学通路进行分析。信号通路富集分析结果见图5和表2，LMSC巨噬细胞激活作用靶点蛋白主要参与10条巨噬细胞激活相关信号通路，归纳为以下4类：Fcγ受体依赖的吞噬作用、TNF-α NF-κB信号通路、糖酵解/糖原异生以及柠檬酸（TCA）循环和呼吸电子运输。
4 讨论
现代研究报道中药及天然药物具有广泛的生物学活性，但由于化学组成十分复杂，如何阐明中药及天然药物复杂成分体系的作用机制，至今仍面临挑战。基于分子亲和色谱法的小分子靶标蛋白捕获技术，本研究结合肉苁蓉分子糖（LMSC）中主要成分均具有羟基这一化学组成共性，构建了LMSC键合的环氧活化琼脂糖凝胶微球作为亲和介质，以此鉴定具有巨噬细胞激活作用的LMSC靶点蛋白群，并对靶点群相关的信号传导通路进行分析，进而揭示了LMSC巨噬细胞激活作用机制。
巨噬细胞是机体内具有吞噬颗粒型抗原作用的一类重要的免疫应答细胞[10]。外源物刺激引起的巨噬细胞激活主要表现为吞噬功能的增强以及一系列信号传导途径引起的NO等因子的释放。LMSC剂量依赖性提高RAW264.7细胞吞噬活性并显著提高NO释放，表明LMSC具有巨噬细胞激活作用。利用生物信息学手段对分子亲和色谱法捕获的LMSC巨噬细胞激活作用靶点进行信号通路富集分析，提示LMSC通过调节Fcγ受体依赖的吞噬作用、TNF-α NF-κB信号通路、糖酵解/糖原异生以及柠檬酸（TCA）循环和呼吸电子运输等过程发挥巨噬细胞激活作用。
Fcγ受体是细胞表面受体，是巨噬细胞模式识别受体之一[11]，其位于细胞表面，能够特异性识别外源性颗粒，使颗粒结合到细胞表面。Fcγ受体介导的吞噬作用信号传导可引起下游肌动蛋白聚合及吞噬体的形成[11]。LMSC显著提高RAW264.7细胞吞噬活性，其作用可能与通过结合Hsp90等多种Fcγ受体信号传导相关蛋白进而调节Fcγ受体依赖的吞噬作用相关。NF-κB信号通路被认为是巨噬细胞激活的一条关键信号传导途经[12]。NF-κB是细胞核内一种重要转录调节因子，NF-κB信号通路激活可以引起胞浆中NF-κB活化而移位至细胞核，进而介导各种细胞因子和NO等介质的基因表达。LMSC刺激后可引起RAW264.7细胞大量释放NO，其作用可能是通过结合Eef2等多种涉及TNF-α NF-κB信号通路等相关蛋白进而激活NF-κB信号通路及与之相关的真核翻译起始与延长过程而实现的。此外，LMSC相关靶点还涉及糖酵解/糖原异生以及柠檬酸（TCA）循环和呼吸电子运输2种糖类代谢途径，推测LMSC含有的果糖、甘露醇等多种低分子糖对RAW264.7细胞进行能量供给并与糖代谢相关的Aldoa等蛋白结合，进而调控糖代谢相关途径。
综上所述，本研究利用分子亲和色谱相关靶标蛋白识别技术鉴定得到LMSC巨噬细胞激活作用的24个不同功能靶点蛋白；靶蛋白相关的信号通路富集分析提示LMSC通过作用于Fcγ受体依赖的吞噬、TNF-α NF-κB信号通路以及糖代谢过程最终发挥RAW264.7巨噬细胞激活作用。该研究为揭示肉苁蓉免疫调节作用活性组分与相关作用机制提供了理论支持，同时为天然药物复杂活性成分群的靶点识别及作用机制研究提供了思路。
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[责任编辑 张宁宁]