[摘要] 目的 探讨碳酸氢钠（NaHCO3）对肝癌生长的影响及其机制。 方法 5只7周龄裸鼠于无特定病原体（SPF）条件下的层流架中饲养，皮下注射肝癌细胞株HepG2细胞构建肝癌模型，并通过肿块内局部注射5%NaHCO3，体内研究肝癌肿块生长及组织坏死。Calcein/PI染色和流式细胞技术体外研究不同酸碱环境和NaHCO3作用下HepG2凋亡情况。蛋白印迹技术检测NaHCO3作用下HepG2细胞凋亡调控蛋白Bax/bcl2表达水平。 结果 5只裸鼠肝癌5%NaHCO3局部注射4周，3只肿块明显缩小，1只肿块长大，1只小鼠实验过程中死亡。5%NaHCO3 3/4、1/2、1/4、1/8、1/16和0（对照）培养基体积占比，Calcein/PI染色显示HepG2细胞凋亡率依次减低。流式细胞分析显示5%NaHCO3 1/2、1/4、1/8、1/16体积占比和对照组细胞凋亡率也依次减低。Calcein/PI染色显示培养基pH6.0、pH6.25、pH6.5、pH6.75、pH7.0、pH7.25、pH7.5、pH7.75、pH8.0的HepG2细胞凋亡率在pH7.0～7.25最低，随着酸碱度的增加凋亡率逐渐增加。流式细胞分析培養基pH6.25、pH6.5、pH6.75、pH7.0、pH7.25和pH7.5组细胞凋亡率变化显示类似结果。5%NaHCO3占1/4培养基体积比条件下HepG2细胞促凋亡的Bax mRNA和蛋白水平与对照相比较无明显变化，而抑凋亡的bcl2 mRNA和蛋白水平明显低于对照组。 结论 NaHCO3可通过改变肝癌组织内环境酸碱度，继而抑制凋亡功能蛋白blc2诱导肝癌细胞凋亡。
[关键词] 碳酸氢钠；肝细胞癌；凋亡；治疗
[中图分类号] G735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）08（b）-0009-04
[Abstract] Objective To explore the apoptotic mechanism of hepatocellular carcinoma （HCC） induced by sodium bicarbonate （SB）. Methods HepG2 cells were implanted the subcutaneous of 5 athymic mice （7-week age） to form hepatocarcinoma mouse model and the growth and necrosis of hepatocellular carcinoma was observed under the condition of local mass injection of 5% SB. The apoptosis of hepatocellular carcinoma cell line HepG2 was observed by Calcein/PI staining and flow cytometry at SB exposure and different pH gradients. The expression of Bax/bcl2 were also detected in HepG2 cells under SB exposure by real-time PCR and western blotting. Results Animal in vivo studies revealed that 5% SB local injection for 4 weeks could inhibit tumor growth and cause tumor necrosis in 3 of 5 hepatocarcinoma mice. One hepatocarcinoma mice died and another mice had an enlarged tumor. 5% SB was diluted to the volume ratio 3/4， 1/2， 1/4， 1/8， 1/16 and negative control by DMEM and Calcein/PI staining in vitro showed that HepG2 apoptosis mice decreased in turn. Flow cytometry showed the similar results in 5% SB volume ratio： 1/2， 1/4， 1/8 and 1/16. The medium DMEM was titrated to pH6.0， pH6.25， pH6.5， pH6.75， pH7.0， pH7.25， pH7.5， pH7.75 and pH8.0. The lowest rate of HepG2 apoptosis was at pH7.0 and pH7.25. As the increasing of acidity or alkalinity， the apoptosis rate of HepG2 increased gradually. Flow cytometry also showed the similar results. Compared with control， Bax mRNA and protein expression in SB exposed HepG2 cell were not changed， but bcl2 mRNA and protein expression were decreased. Conclusion SB can induce HCC apoptosis by changing the internal environmental pH and inhibiting the expression of apoptotic protein blc2.
[Key words] Sodium bicarbonate； Hepatocellular carcinoma； Apoptosis； Treatment
由于慢性乙型肝炎病毒感染人口基数较大，肝癌在中国有很高的发病率[1]。因此，对于肝癌的有效治疗具有非常重要的意义[2-3]。目前肝癌治疗手段主要为手术切除和介入治疗[4]，而肝癌介入治疗主要为肝动脉栓塞化疗和射频消融[5-6]。有研究发现碳酸氢钠可提高肝动脉栓塞化疗对肝癌的疗效[7-8]，但确切机制尚不完全清楚。本研究通过体内外研究方法探索碳酸氢钠对肝癌生长的影响及其可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物、细胞和实验材料
5只7周龄胸腺缺失小鼠（裸鼠）购自中国人民解放军军事医学科学院，HepG2细胞株来自北京市肝病研究所。小鼠抗bcl2单克隆抗体购自Santa Cruz公司（USA）；兔抗bax多克隆抗体购自Abcam公司（Cambridge，UK）；碘化丙啶（propidium iodide，PI）、β-actin单克隆抗体购自Sigma公司（St. Louis，MO）；辣根过氧化物酶标记抗小鼠和抗兔二抗购自Jackson公司（USA）；钙黄绿素-AM（Calcein）购自Invitrogen公司（Eugene，OR）；DMEM培养基，青/链霉素购自Gibco公司；牛血清白蛋白（BSA）购自罗氏公司（IN， USA）；鼠FITC-IgG1/PE-IgG1单抗为Pharming公司产品；其他相关分析纯试剂购自国内生产公司。实验组与对照组小鼠给予相同光照、室温、饲料等饲养条件，并在无特定病原体（SPF）条件下的层流架中饲养。严格按照《首都医科大学实验室实验动物使用管理规定》使用实验动物，实验动物合格证号2012-0004。
1.2 细胞培养和Calcein/PI吸收试验
无菌条件下，使用含15%胎BSA和1%青/链霉素的DMEM培养基将复苏的HepG2细胞平铺在12孔培养板，细胞浓度为1×104/cm2。并按照实验设计加入特定的酸性或碱性液体，置于37℃、体积分数为0.05 CO2恒湿培养箱温育24 h进行相关细胞和蛋白实验。Calcein/PI吸收试验通过细胞培养基中加入1 μg/mL Calcein-AM 37℃温育30 min，再加入10 μg/mL PI温育15 min，倒置荧光显微镜下观察并计数存活和凋亡的神经细胞。Calcein-AM染成活细胞，呈绿色；PI染凋亡/死亡细胞，为红色，其中死亡细胞核固缩，凋亡细胞核大而松散。40倍物镜下每个实验点取3个视野计数的平均数。通过荧光显微镜下细胞计数，并依据公式：PI/（PI+Calcein-AM）×100%计算凋亡细胞所占比例。
1.3 流式细胞技术
去除处理后的HepG2细胞培养基，加入1×PBS稀释的储存浓度为10 mg/mL的HE于二甲基亚砜（DMSO中储存）（Polysciences， Warrington，PA），使终浓度为50 μg/mL。避光，37°C孵育10 min。最后用BDFACSDiva流式细胞仪对细胞进行分析（BD FACS CantoTM Ⅱ）。HE在490 nm波长处被激发，在620 nm波长处可被检测到。储存10 000个细胞的数据，然后用CellQuest软件进行分析。
1.4 核酸提取和实时定量PCR检测
通过RNA提取试剂盒（Biomed Biology，北京）提取总RNA，应用Superscript HI Rt-PCR首链合成系统试剂盒（Invitrogen），将提取的RNA反转为cDNA，具体操作按照说明书进行。采用Taqman探针法进行实时定量PCR（qPCR）检测Bax和blc2 mRNA水平。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因为内参。引物和探针由上海Invitrogen公司合成，具体实验步骤和引物探针见文献[9]。依照相对于对照组基因拷贝增减的倍数等于2-△△CT的相对定量法计算实验组基因变化。使用仪器为美国TaqMan 7900 TqPCR检测系统。
1.5 蛋白提取与蛋白印迹
HepG2细胞通过RIPA裂解液裂解，蛋白浓度通过BCA 蛋白检测试剂盒检测（Biomed Biology，北京）。蛋白质印迹一抗用1×PBS+3% BSA（1∶1000）稀释，二抗用1×PBS+3%脱脂牛奶（1∶1000）稀释。12%聚丙烯酰胺凝胶蛋白（30 μg）上样，30 V电压转膜（硝酸纤维素膜）过夜，5%脱脂牛奶封闭，一抗（抗小鼠bcl2和抗β-actin单克隆抗体与抗兔Bax多克隆抗体）37℃温育1 h，二抗（对应的辣根过氧化物酶标记抗小鼠二抗和抗兔二抗）室温1 h，暗室发光洗片并扫描成像。
1.6 肝癌动物模型构建与碳酸氢钠处理
培养HepG2细胞，使得细胞浓度达到6×106/mL。取5只裸鼠皮下注射上述HepG2细胞0.2 mL，SPF条件下饲养2周见小鼠皮下种植HepG2细胞部位长出实性肿块，且逐渐长大，考虑荷瘤成功。第3周开始隔日1次0.2 mL NaHCO3肿块内注射，连续4周。观察肿块生长情况。
1.7 石蜡切片和HE染色
通过颈部脱臼处死实验小鼠并迅速解剖分离肿瘤组织，10%甲醛固定，乙醇脱水并予以二甲苯透明，石蜡包埋，用切片機切成6 μm厚薄片，45℃恒温箱中烘干，将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色5 min，酸水及氨水中分色，各10 s，流水冲洗1 h后入蒸馏水5 min，入70%和90%酒精中脱水各10 min，入酒精伊红染色液染色3 min，染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明，将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。显微镜下读片拍照。
1.8 统计学方法
采用PASW statistics 18统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 局部注射碳酸氢钠对肝癌肿块生长和肝癌组织坏死的影响
5%NaHCO3局部注射组5只小鼠4周观察发现，3只肿块明显缩小，1只疗效较差出现肿块进一步长大，1只小鼠实验过程中死亡（图1A）。针对肝癌组织的HE染色发现5%NaHCO3干预可引起肿块组织坏死（图1B）。
2.2 碳酸氢钠对肝癌细胞凋亡的影响
5%NaHCO3被按照不同体积占比替换肝癌细胞株HepG2细胞培养基DMEM。在5%NaHCO3完全替换DMEM情况下，HepG2细胞迅速死亡。因此，实验所用5%NaHCO3所占DMEM培养基体积比依次为3/4， 1/2，1/4，1/8，1/16和0（对照）。HepG2细胞培养24 h后观察细胞凋亡情况。研究发现，细胞凋亡率与5%NaHCO3所占培养基体积比呈正相关，在NaHCO3（1/8）组对HepG2细胞生长影响即明显减弱。通过流式细胞进一步分析细胞凋亡情况，因NaHCO3（3/4）组细胞几乎全部死亡，故观察NaHCO3（1/2）、NaHCO3（1/4）、NaHCO3（1/8）、NaHCO3（1/16）和对照组，其细胞凋亡率依次减低。见图2（封三）。
2.3 不同pH值条件下肝癌细胞凋亡情况
由于HCO3-是调节人体体液酸碱平衡重要的碱性阴离子，假设NaHCO3通过形成肿瘤细胞外液碱性微环境诱导肝癌细胞凋亡。由此，滴定HepG2细胞培养基DMEM酸碱度，形成pH6.0、pH6.25、pH6.5、pH6.75、pH7.0、pH7.25、pH7.5、pH7.75、pH8.0等不同pH值DMEM培养基。HepG2细胞分别在上述培养基中培养24 h后观察细胞凋亡情况。Calcein/PI染色显示pH7.0～7.25细胞凋亡率最低。随着酸度或碱度的逐渐加大，细胞凋亡率逐渐增高。通过流式细胞进一步分析细胞凋亡情况，因pH6.0、pH7.75和pH8.0组细胞死亡率极高，故观察pH6.25、pH6.5、pH6.75、pH7.0、pH7.25和pH7.5组，其细胞凋亡情况和上述结果类似。见图3（封三）。
2.4 碳酸氢钠通过抑制凋亡调控蛋白bcl2的表达诱导肝癌细胞凋亡
为了进一步探索碳酸氢钠所导致的肝癌细胞凋亡机制，取细胞凋亡调控两个重要蛋白Bax/bcl2进行研究，通过实时定量PCR和蛋白印迹方法观察5%NaHCO3对Bax/bcl2 mRNA和蛋白表达水平的影响。研究发现5%NaHCO3占1/4培养基体积比条件下培养24 h的HepG2细胞促凋亡的Bax mRNA表达水平改变不明显，而bcl2 mRNA表达水平明显减低。进一步蛋白研究显示实验组Bax无明显改变。抑凋亡的bcl2相对于β-actin平均蛋白表达水平明显减低。见图4。
3 讨论
肝癌是肝细胞起源的恶性肿瘤，占世界男性恶性肿瘤发病第5位和女性第9位[10]。我国人群发生肝癌多数与慢性乙型肝炎病毒感染相关[11]。目前对于肝癌治疗多数采用手术肿瘤切除、局部介入治疗以及生物靶向治疗等。介入治疗往往联合肝动脉栓塞化疗和经皮肝穿刺肝癌射频消融治疗等[5，12]。有报道NaHCO3被用于肝动脉栓塞化疗的辅助治疗。
肿瘤细胞的生理活动离不开稳定的细胞内和组织间液的pH值。人体血液正常pH值为7.35～7.45，组织液pH值一般为7.0～7.5，而细胞浆的pH值是7.20～7.45[8]。不同组织液和细胞液pH值可以存在较大差异。细胞生命活动过程中会产生多种酸性和/或碱性物质影响身体内环境的酸碱度，而另一方面正常人体存在着非常有效的酸碱调节系统用来维持机体的酸碱平衡，比如血液HCO3-/H2CO3的迅速调节作用，肺通过呼出二氧化碳排出体内可挥发性酸，肾脏通过肾小球排出不可挥发性酸性代谢产物以及肾小管重吸收NaHCO3和电解质来相对持久性调节机体酸碱平衡等[13-14]。
NaHCO3通过改变肿瘤细胞或组织局部酸碱度来抑制肿瘤细胞生长和正常功能活动理论上是可行的[15-16]，因为其生长和正常功能活动所需要的酶的活性受到抑制，不能发挥其正常功能。本研究也证实NaHCO3改变肝癌组织细胞内环境酸碱度，通过细胞凋亡功能蛋白抑制肝癌肿瘤生长。
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（收稿日期：2018-04-18 本文编辑：李岳泽）