摘要目的：觀察鲜生地黄对慢加急性肝衰竭大鼠JAK2/STAT3通路的影响。方法：30只雄性Wistar大鼠按照1∶4比例随机分为对照组和实验组。实验组大鼠先用四氯化碳诱导成肝纤维化模型，再按照1∶1比例随机分为模型组和观察组，应用D氨基半乳糖进行急性攻击，建立慢加急性肝衰竭大鼠模型。观察组在急性攻击前7 d予以鲜生地黄连续灌胃。各组大鼠分别在急性攻击后24 h取材，检测血清内毒素、白细胞介素6含量及肝脏组织中JAK2mRNA、STAT3mRNA的表达。结果：模型组大鼠肝组织中JAK2mRNA、STAT3mRNA表达低于对照组和观察组，差异有统计学意义（P<005）。观察组与对照组大鼠肝组织中JAK2mRNA、STAT3mRNA表达差异无统计学意义（P>005）。模型组大鼠血清内毒素显著高于对照组和观察组，差异有统计学意义（P<001）;观察组与对照组比较，大鼠血清内毒素表达差异无统计学意义（P>005）。模型组大鼠血清白细胞介素6高于对照组和观察组，但差异无统计学意义（P>005）。结论：鲜生地黄能够降低肠道内毒素的吸收，促进JAK2/STAT3通路活化，但是介导物质可能并不是IL6，相关机制需要进一步完善。
关键词鲜生地黄;慢加急性肝衰竭;JAK2;STAT3
Effects of Fresh Radix Rehmanniae Recens on JAK2/STAT3 Pathway in Acuteonchronic Liver Failure Rats
Guo Liying1，2，Li Qiuwei1，2，Li Li1，Miao Jing2，Jia Jianwei2
（1 Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China; 2 Tianjin Second People′s Hospital，Tianjin 300192，China）
AbstractObjective：To observe the effect of fresh Radix Rehmanniae Recens on JAK2/STAT3 pathway in acuteonchronic liver failure rats.Methods：Thirty male Wistar rats were randomly divided into control group and experimental group according to 1∶4 ratio.Rats in experimental group were firstly induced to hepatic fibrosis model with carbon tetrachloride，and then randomly divided into model group and treatment group according to the ratio of 1∶1.Acute attacks were performed with Dgalactosamine and a rat model of chronic acute liver failure was established.The treatment group was given intragastrically with the fresh Radix Rehmanniae Recens 7 days before the acute attack.Rats in each group were harvested 24 hours after acute challenge.Serum endotoxin，interleukin6 levels，and expression of JAK2 mRNA and STAT3 mRNA in liver tissue were measured.Results：The expression of JAK2 mRNA and STAT3 mRNA in the liver tissue of the model group was lower than that in the control group and the model group.The difference was statistically significant （P<005）.There was no significant difference in the expression of JAK2 mRNA and STAT3 mRNA between the treatment group and the control group （P>005）.The serum endotoxin level in the model group was obviously higher than that in the control group and the treatment group，and the difference was statistically significant （P<001）.There was no significant difference in serum endotoxin expression between the treatment group and the control group （P>005）.Serum interleukin6 levels in the model group were higher than those in the control group and the treatment group，but the difference was not statistically significant （P>005）.Conclusion：Fresh Radix Rehmanniae Recens can reduce the absorption of toxins in the intestine and promote the activation of JAK2/STAT3 pathway，but the mediator may not be IL6，and the relevant mechanisms need to be further improved.
Key WordsFresh Radix Rehmanniae Recens; Chronic plus acute liver failure; JAK2; STAT3
中图分类号：R7433文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.039
肝衰竭属于中医学“急黄”“瘟黄”范畴，“湿、热、瘀”是肝衰竭的主要病理基础，“毒、虚”是肝衰竭的特有病理因素，“热、毒”是疾病进展的关键[1]。鲜生地黄既可以清热凉血，又可以养阴生津，因此它可以作用于肝衰竭的多个病理过程，在临证中获得一定的疗效[24]，但是其作用机制尚不明确。酪氨酸激酶2（JAK2）/转录因子3（STAT3）信号通路是肝损伤发展过程中的重要调控机制。因此本研究基于JAK2/STAT3通路，初步探讨鲜生地黄治疗肝衰竭的可能作用机制。
1材料与方法
11材料
111实验动物清洁级雄性Wistar大鼠30只，质量（220±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（动物许可证号：SCXK2016006）。实验前在恒温（25 ℃）、光照周期12 h/12 h环境中适应性饲养1周。
112药物鲜生地黄生地黄采自河南省武陟县，清洗后真空冰冻保鲜技术处理，用前榨汁。
113试剂与仪器
1131主要试剂TRNzol总RNA提取试剂由天根生化科技（北京）有限公司，生产批号：DP40502。PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser由TaKaRa生物有限公司，生产批号：RR047B。Premix Ex TaqTM（探针法mix）由TaKaRa生物有限公司，生产批号：RR390L。所用的JAK2、STAT3目的基因引物、探针均由北京Invitrogen公司合成。D氨基半乳糖（DGal）购自上海市阿达玛斯试剂有限公司，批号：P1243553。四氯化碳（CCl4）购自天津市化学试剂供销公司，批号：160918。橄榄油购自天津市化学试剂供销公司，批号：161205。
1132主要仪器QL902涡旋振荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）;Centrifuge 5415D离心机（Eppendorf公司）;分光光度NANODROP 2000（Therno scientific公司）;凝胶成像系统Tanon 1600（上海天能科技有限公司）;荧光定量PCR仪ABI7500（Applied Biosystems公司）;ELX800型酶标仪（美国BIOTEK公司）。
12方法
121分组与模型制备
1211动物模型制备参考朴正福、张海燕等[56]方法建立慢加急性肝衰竭大鼠模型。
1212肝纤维化大鼠模型制备将CCl4与橄榄油按照1∶1配制成50%CCl4橄榄油溶液，按照2 mL/kg剂量，给予大鼠腹腔注射，1次/3 d，连续8周，建立肝纤维化大鼠模型。
1213慢加急性肝衰竭大鼠模型制备DGal与09%氯化钠溶液按照1∶10配制成DGal溶液。肝纤维化模型大鼠禁食24 h，不禁水，按照2 g/kg剂量，腹腔注射DGal溶液，建立慢加急性肝衰竭大鼠模型。
1214分组采用SPSS 220统计软件进行随机化处理。30只Wistar大鼠按照1∶4比例随机分为2组，空白对照组（简称对照组）6只，自由饮水进食;实驗组24只，自由饮水进食，并按照1212方法应用50%CCl4橄榄油溶液建立肝纤维化模型。8周后从实验组中随机抽取6只大鼠验证肝纤维化模型成立后，余下的大鼠按照1∶1比例随机分为模型组和观察组，按照1213方法应用DGal进行急性攻击，建立慢加急性肝衰竭大鼠模型。
122给药成模前1周开始进行药物干预。对照组、模型组按照025 mL/100 g剂量给予生理盐水灌胃，1次/d;观察组按照025 mL/100 g剂量给予鲜生地黄汁灌胃，1次/d。取材：慢加急性肝衰竭大鼠模型成立24 h后，麻醉解剖大鼠，采集门静脉血液，于3 000 r/min离心10 min后留取上清，液氮保存后转移到-80 ℃冰箱冻存，待测;取肝左叶组织液氮保存后转移到-80 ℃冰箱冻存，待测。
123检测指标与方法
1231一般情况观察每天记录各组大鼠饮食量及体重，观察皮毛及大便情况。
1232血清内毒素、IL6检测采用酶联免疫吸附法进行检测。往预先包被的内毒素（ET）、白细胞介素6（IL6）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温浴并彻底洗涤，用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化为蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和ET、IL6呈正相关。用酶标仪在450 nm波长测定吸光度，计算样品浓度。
1233肝组织中JAK2、STAT3的mRNA检测采用Real Time PCR taqman探针方法检测目的基因mRNA，以GAPDH为内参照，双标准曲线法进行相对定量。肝脏组织放入已预冷的研钵中进行研磨成粉末状，按TRNzol总RNA提取试剂说明书提取RNA，并应用紫外吸收测定法检测浓度和纯度。然后采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser进行cDNA反转录。取cDNA样品配置Realtime PCR反应体系进行PCR反应。PCR反应体系为20 μL，Master Mix（2×）10 μL，上下游特异引物各05 μL，探针05 μL。PCR反应条件：95 ℃孵育30 s，然后95 ℃延伸5 s重复循环39次，末次循环60 ℃延伸至40 s，收集荧光。JAK2引物序列（5′to3′）：上游TATGCGAATGATCGGCAATG，下游AAATCTCGTCTGGGCACCCT，探针FAMAAGGGCAGATGATCGTATTCCATTTBHQ1;STAT3引物序列（5′to3′）：上游TGATAAGGACTCTGGGGATG，下游GGGTCAGGTGCTTGAACTCT，探针FAMCCTCAGAGGGTCTCGGAAATTTAACBHQ1。其中Reporter为FAM，Quencher为BHQ1。目的基因和内参分别进行Realtime PCR反应，每个样本检测3个复孔。数据采用2△△ CT法进行分析。每一份标本均行复管检测，取其均值做为目的基因的表达水平。
13统计学方法采用SPSS 220统计软件进行数据分析，行正态性检验和方差齐性检验，所有数据均以均数±标准差（±s）表示，符合正态分布且方差齐的数据应用单因素方差分析LSD检验;呈偏态分布或方差不齐则作多组样本秩和kw检验。以P<005为差异有统计学意义。
2结果
21一般情况比较对照组大鼠毛发光泽，活动多，精神状态好，大便正常。实验组大鼠在给予CCl4过程中，毛发凌乱无光泽，易急惹，皮肤逐渐黄染，体重增长缓慢。8周时实验组大鼠死亡2只，随机抽取6只大鼠中解剖发现有2只出现腹水。DGal急性攻击后，模型组和观察组大鼠逐渐出现精神萎靡，黄疸加重，部分可见口鼻出血症状，至24 h模型组死亡1只。
22肝组织JAK2mRNA、STAT3mRNA表达3组大鼠肝组织中JAK2mRNA、STAT3mRNA表达差异有统计学意义（P<001）。对照组及观察组大鼠肝组织中JAK2mRNA、STAT3mRNA表达均高于模型组，差异有统计学意义（P<001）。对照组与观察组比较，大鼠肝组织中JAK2mRNA、STAT3mRNA表达差异无统计学意义（P>005）。见表1。
3讨论
肝衰竭是多种病因所致的严重肝脏损害，导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，出现以凝血功能障碍、黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床征候群，预后差，病死率高，是肝脏病中常见的危重病。肝衰竭发病机制可以概括为免疫损伤、缺血缺氧损伤、内毒素血症“三重打击学说”[7]，核心表现在肝细胞死亡、炎性反应细胞浸润和微循环障碍三方面，其中肝细胞大量坏死及有效再生的缺乏是肝衰竭死亡的主要原因[8]。因此肝细胞的有效再生，是改善肝衰竭预后的重要因素。酪氨酸激酶JAK/转录因子STAT参与了许多细胞因子及生长因子介导的细胞增殖及分化等生物过程，特别是STAT蛋白已被证实在细胞因子诱导细胞增殖过程中占有重要地位，其中JAK2/STAT3通路在成人肝脏中表达，并参与肝再生、免疫等过程[910]。研究[11]表明在肝脏局部切除术后多种早期即刻基因被立即激活。IL6负责激活这些基因的40%。IL6可活化STAT，许多研究表明这就是肝再生的开始[12]。
鮮生地黄甘寒质润，养阴生津同时又可清热凉血，将其应用于肝衰竭治疗中可凉血解毒、清营护络;可增水濡络而行血;调和阴阳，生津养液，滋补肝肾，整体作用于肝衰竭“三重打击学说”中的各个阶段。现代研究[1314]表明中药养阴生津作用主要体现在调控细胞增殖方面。为进一步明确鲜生地黄作用机制，我们探讨了鲜生地黄对JAK2/STAT3通路影响。
本研究证实了鲜生地黄能够提高慢加急性肝衰竭大鼠模型中肝组织中JAK2mRNA、STAT3mRNA的表达（P<005），达到正常大鼠水平（P>005）;能够降低慢加急性肝衰竭大鼠模型门静脉ET水平（P<005），但是不能改善早期免疫损伤所致的IL6升高的结局（P>005）。因此我们推测鲜生地黄能够降低肠道内毒素的吸收，能够促进JAK2/STAT3
通路活化，但是介导物质并不是IL6，相关机制需要进一步完善。
参考文献
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（2018-04-17收稿责任编辑：王明）