[摘要] 目的 探讨高压氧对急性一氧化碳中毒大鼠少突胶质细胞前体细胞ADAM10 mRNA表达的影响。 方法 体外纯化培养新生大鼠皮层少突胶质细胞前体细胞（OPCs），按3种处理方式分为对照组、急性一氧化碳中毒组（ACOP组）、高压氧组（HBO组）。对照组不进行任何处理；ACOP组将细胞放在密闭容器内，根据体积比例注入1%一氧化碳；HBO组将一氧化碳处理的OPCs放入动物实验舱中，以98%O2、2%CO2洗舱10 min，然后15 min内加压至0.35 MPa并停留2 h，20 min内减至常压，处理期间舱温控制在37℃，余处理同ACOP组。以HBO处理后即刻为0 h，三组均在6、24 h和48 h时间点取材；采用RT-PCR方法觀察不同时间点OPCs细胞ADAM10 mRNA的表达。 结果 在6、24 h和48 h三个时间点，大鼠少突胶质细胞前体细胞ADAM10 mRNA在对照组无明显变化，ACOP组逐渐减少，HBO组逐渐增多，差异有统计学意义（F = 8.491，P < 0.01）；与对照组在6、24 h和48 h三个时间点大鼠少突胶质细胞前体细胞ADAM10 mRNA水平比较，ACOP组均明显减少，HBO组均明显增加（F = 88.692，P < 0.01）。 结论 大鼠少突胶质细胞前体细胞ADAM10分子在一氧化碳中毒造成的脑白质损伤及高压氧治疗中发挥重要作用。
[关键词] 高压氧；一氧化碳中毒；少突胶质细胞前体细胞；ADAM10
[中图分类号] R595.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）02（b）-0009-04
[Abstract] Objective To investigate the effect of hyperbaric oxygen （HBO） treatment on the xpression of Oligodendrocyte Precursors （OPCs） ADAM10 mRNA in the acute carbon monoxide poisoning（ACOP） rats. Methods OPCs cells of neonatal rat were cultured in vitro and divided into three groups： control， ACOP and HBO groups. Control group： no treatment， ACOP group： the OPC cells were placed in a sealed container and injected with 1% carbon monoxide according to the volume ratio， HBO group： OPCs cells after ACOP were placed in animal experiments of hyperbaric oxygen chamber， with 98% O2， 2%CO2 washing 10 min， then 15 min 0.35 MPa pressure staying 2 h， at last 20 min reducing to normal pressure. The chamber temperature was controlled at 37℃. The end time of HBO treatment was set as 0 h， the three groups were collected at 6 ， 24 h and 48 h for subsequent experiments. The expression of ADAM10 mRNA at 6， 24 h， and 48 h were detected by RT-PCR. Results 6， 24 h， and 48 h， the expression of ADAM10 mRNA was no change in control group， but gradually decreased in ACOP group， and increased in HBO group， there was statistically significant among the three groups （F = 8.491， P < 0.01）. Compared with control group， the expression of ADAM10 mRNA at 6， 24， 48 h was significantly reduced in ACOP group， while was significantly increased in HBO group （F = 88.692， P < 0.01）. Conclusion ADAM10 of OPCs may play an important role in the injury of central nervous system after ACOP and HBO.
[Key words] Hyperbaric Oxygen； acute carbon monoxide poisoning； Oligodendrocyte precursors； ADAM10
急性一氧化碳中毒（acute carbon monoxide poisoning，ACOP）是最常见的职业性及生活性中毒之一，可造成全身多个脏器损害，其中以中枢神经系统（central nervous system，CNS）损伤危害最大，造成巨大社会、经济负担[1]。一氧化碳中毒迟发性脑病（delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP）是ACOP后最主要的神经精神后遗症，表现为部分患者急性中毒症状消失以后，经过数天或数周表现正常或接近正常的假愈期后又出现以痴呆为主的精神、神经症状。脑白质脱髓鞘改变是DEACMP最显著的病理学和颅脑影像学表现，但其机制仍不清楚[2]。
ADAM10是解聚素和金属蛋白酶（A Disintegrin And Metalloproteinase，ADAM）家族的重要一员，具有调节细胞黏附和金属蛋白酶双重功能，参与发育等诸多生理病理过程，是阿尔兹海默病、肿瘤、炎症等疾病的潜在治疗靶点[3]。已有研究发现，ADAM10不但在外周神经系统（peripheral nervous system，PNS）的雪旺氏细胞有表达，而且在CNS的少突胶质细胞前体细胞（Oligodendrocyte Precursors，OPCs）和少突胶质系细胞（Oligodendrocyte，OLs）也有表达[4]。鉴于ADAM10蛋白的分布特点，结合DEACMP最主要病理特征是白質脱髓鞘病变，我们推测ADAM10可能参与ACOP后脱髓鞘病变的病理生理过程。
高压氧（Hyperbaric Oxygen，HBO）是治疗ACOP和DEACMP的重要方法之一。有研究表明，HBO可促进ACOP后损伤髓鞘再生，还具有诱导神经干细胞分化的功能[5-6]。我们前期研究发现，ACOP导致大鼠OPCs增殖和分化能力下降，HBO可一定程度改善OPCs的功能，但机制仍不清楚[7]。因此，本实验采用差速贴壁法体外纯化培养大鼠OPCs，建立OPCs的ACOP细胞模型，观察高压氧对ACOP后OPCs细胞ADAM10 mRNA水平的影响，探讨HBO治疗ACOP后髓鞘损伤和DEACMP可能的神经保护作用机制。
1 材料和方法
1.1 动物与试剂
实验用SD大鼠购自军事医学科学院实验动物中心，新生鼠（P0），动物合格证号：SGXK（京） 20022003。胎牛血清、DMEM/HIGH GLUCOSE培养液、N2 supplement（100×）、胰蛋白酶、B27 supplement（50×）、DMEM/F12购自美国GIBCO公司；多聚赖氨酸（poly-lysine，PLL）、DAPI试剂购自美国Sigma公司；Rat FGF、Human PDGF-AA购自Peorotech公司；RT-PCR试剂盒购自TAKARA公司。
1.2 体外OPCs纯化培养
新生SD大鼠经75%乙醇消毒后，用眼科剪和眼科镊取脑，在PBS液中充分漂洗，剔除脑膜，脑组织用眼科剪剪成小块，置于37℃ 0.125%胰酶中消化10 min，含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，用巴氏管反复吹打脑组织使其分散成细胞悬液，细胞悬液用200目的筛网过滤，过滤后悬液置于4℃的低温离心机中以1600 r/min的速度离心8 min，弃去上清液，用培养基重悬细胞沉淀，接种于用多聚赖氨酸预包被的细胞培养瓶中，置于普通细胞培养箱（37℃、5%CO2）中培养，次日更换培养基，每3～4天换液1次，直至混合胶质细胞长满培养瓶底（约10 d）。待混合胶质细胞长满培养瓶瓶底后，拧紧培养瓶瓶盖，并用封口胶封闭瓶口，将培养瓶置于37℃恒温摇床振摇，设参数为200 r/min，先预振摇2 h，然后弃上清，更换新的培养基，继续置于37℃恒温摇床振摇，参数不变，振摇16～20 h后转移振摇后的细胞上清，种于未包被的100 mm培养皿（Corning）中，置于37℃ 5%CO2培养箱中，静置贴壁30 min，吸取上清，收集上清于离心管中800 r/min离心5 min，弃去上清，用OPCs培养基（含10 ng/mL PDGF-AA、10 ng/mL FGF、1×N2、1×B27的DMEM/F12培养基）重悬后，种于含有PLL预包被的盖玻片的24孔板及96孔板中。OPCs隔天换液。
1.3 实验分组及处理
OPCs纯化培养3 d后，将细胞分为三组：对照组、ACOP组和高压氧组。①对照组：无CO处理；②ACOP组：将细胞放在密闭容器内，根据体积比例注入1%CO（用一氧化碳检测仪检测，容器内一氧化碳浓度为10 000 ppm）；③HBO组：将一氧化碳处理的OPCs放入动物实验舱中，以98%O2、2%CO2洗舱10 min，然后15 min内加压至0.35 MPa并停留2 h，20 min内减至常压，处理期间舱温控制在37℃，余处理同ACOP组。以HBO处理后为0 h，三组均在6、24 h和48 h取材进行后续实验。
1.4 RT-PCR测定ADAM10 mRNA表达
培养终止，三组培养皿中加入Trizol将细胞消化，常规提取总RNA。紫外分光光度计进行测定A260/A280，计算总RNA含量和纯度>1.8；琼脂糖凝胶电泳可见完整18S、28S两条带，表明总RNA完整未降解。取250 ng总RNA按反转录试剂盒说明书将总RNA反转录为cDNA，而后加入ADAM10、GAPDH上下游引物进行PCR反应。反应条件为95℃预变性3 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环，后72℃延伸10 min。取PCR反应产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶分析系统仪分析ADAM10和GAPDH的吸光度值（A），计算ADAM10和GAPDH积分吸光度的比值，作为ADAM10 mRNA的表达水平，引物序列如表1。
1.5 统计学方法
采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
三组各时间点大鼠少突胶质细胞前体细胞ADAM10 mRNA表达在对照组无明显变化，ACOP组逐渐减少，HBO组逐渐增多，组内比较差异有统计学意义（P < 0.01）。与对照组各时间点大鼠少突胶质细胞前体细胞ADAM10 mRNA水平比较，ACOP组均明显减少，HBO组均明显增加，组间比较差异有统计学意义（P < 0.01）。见表2、3。
3 讨论
CNS髓鞘由OLs缠绕轴突形成。当CNS髓鞘损伤时，OPCs会迅速增殖并向损伤部位迁移，分化成为成熟的OLs，进行髓鞘修复[8]。然而，这一过程受到诸多因素影响。ADAM10被认为是神经细胞分化、迁移过程的关键因素之一，笔者一直致力对ADAM10在CNS脱髓鞘/再生中的作用和机制进行深入研究。ADAM10是ADAM分子家族中重要一员，在CNS中主要分布于大脑皮质、海马、下丘脑和小脑皮质。ADAM10基因敲除小鼠通常在胚胎期第9.5天（E9.5）左右死亡，体型仅占正常小鼠的2/3，且CNS发育、心血管系统发育、体节形成和血管发生存在明显缺陷[9]。进一步研究发现，ADAM10敲除小鼠在神经系统中观察到的异常主要表现为神经上皮细胞壁的不完整，与Notch/Delta信号缺陷小鼠的表型十分相近[10]。ADAM10在多发性硬化病患者的星形胶质细胞和血管周围的巨噬细胞中表达上调，表明炎症或白质退行性变可以通过增加ADAM10表达来激活炎性细胞因子[11]。ADAM10在胚胎晚期、出生早期的CNS神经元中表达升高[12]。而这一发育阶段正是星形胶质细胞和少突胶质细胞增殖和/或分化的关键时刻，提示ADAM10可能参与到这一过程。此外，在果蝇生长锥和细胞迁移过程中，ADAM10能够激活Slit/Robo复合物促进室管膜下区的成神经细胞迁移[13]。这些研究结果表明ADAM10在CNS的髓鞘发育和损伤修复过程中起到非常重要的作用。
Thom等[14]发现在ACOP后大鼠脑内MBP表达减少，提示CO中毒可导致脱髓鞘改变。孙瑞佼等[15]研究发现ACOP后大鼠发生CNS脱髓鞘及OPCs损伤。Wang等[16]研究发现，大鼠CO中毒后OLs形态发生改变，细胞突起增生、肥大，与星形胶质细胞的激活相似，且数量随损伤时间的增加而逐渐减少。我们前期研究发现，ACOP大鼠OPCs细胞的增殖、分化和迁移功能明显下降[7，17]。HBO作为治疗急性CO中毒及其相关脑病重要方法之一，具有确切的理论和临床基础[18-19]。目前认为机制包括：缩短CO排除半衰期，迅速降低碳氧血红蛋白水平；收缩脑血管，降低颅内压，减轻脑水肿；加速CO与细胞色素氧化酶解离；抑制β2黏附聚集因子介导的白细胞黏附，改善CO介导的CNS损伤相关病理反应，抑制脂质过氧化，减轻白细胞黏附对血管内皮损伤等[20]；促进星形胶质细胞合成和分泌神经生长因子（nerve growth factor，NGF），脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和神经营养素-3（neurotrophin-3，NT-3）的能力[21]。由于ADAM10在CNS生理病理过程中发挥重要功能，我们猜想HBO可能通过ADAM10来影响OPCs细胞功能，从而促进ACOP后髓鞘損伤修复。本次实验采用差速贴壁法体外纯化培养大鼠OPCs，建立OPCs的ACOP细胞模型，研究高压氧对ACOP后OPCs细胞ADAM10 mRNA水平的影响，结果发现：各时间点大鼠少突胶质细胞前体细胞ADAM10 mRNA表达在对照组无明显变化，ACOP组逐渐减少，HBO组逐渐增多；与对照组各时间点大鼠少突胶质细胞前体细胞ADAM10 mRNA水平比较，ACOP组均明显减少，HBO组均明显增加。
本研究提示，HBO很可能通过ADAM10分子信号通路影响OPCs细胞功能，参与CNS髓鞘损伤与修复过程，这可能在阐明ACOP后CNS损伤和DEACMP的发生、发展、预后及高压氧治疗靶点中具有重要意义。然而，本研究仅观察了ADAM10 mRNA水平的变化特点，不能够代表蛋白表达情况，也未研究ADAM10分子与ACOP及HBO后OPCs细胞功能和CNS髓鞘损伤修复的关系，将来有必要通过多种实验手段进一步阐明这一机制。
[参考文献]
[1] Wu PE，DN Juurlink. Carbon monoxide poisoning [J]. Cmaj，2014，186（8）：611.
[2] 武涛，杨小军，党根喜，等.一氧化碳中毒迟发性脑病临床和MRI研究[J].中国实用神经疾病杂志，2010，13（15）：10-12.
[3] Edwards DR，Handsley MM，Pennington CJ. The ADAM metalloproteinases [J]. Mol Aspects Med，2008，29（5）：258-89.
[4] Jangouk P，Dehmel T，Meyer Zu H？rste G，et al. Involvement of ADAM-10 in axonal outgrowth and myelination of the peripheral nerve [J]. Glia，2009，57（16）：1765-1774.
[5] Yang YJ，Wang XL，Yu XH，et al. Hyperbaric oxygen induces endogenous neural stem cells to proliferate and differentiate in hypoxic-ischemic brain damage in neonatal rats [J]. Undersea Hyperb Med，2008，35（2）：113-129.
[6] Thom SR，Bhopale VM，Fisher D. Hyperbaric oxygen reduces delayed immune-mediated neuropathology in experimental carbon monoxide toxicity [J]. Toxicol Appl Pharmacol，2006，213（2）：152-159.
[7] 郭大志，冯园，胡慧军，等.急性一氧化碳中毒对大鼠大脑少突胶质细胞前体细胞分化功能的影响[J].中华航海医学与高气压医学杂志，2017，24（3）：200-204.
[8] Lopez Juarez A，He D，Richard Lu Q. Oligodendrocyte progenitor programming and reprogramming：Toward myelin regeneration [J]. Brain Res，2016，1638（Pt B）：209-220.
[9] Saftig P，Lichtenthaler SF. The alpha secretase ADAM10：A metalloprotease with multiple functions in the brain [J]. Prog Neurobiol，2015，135：1-20.
[10] Bernstein HG，Bukowska A，Krell D，et al. Comparative localization of ADAMs 10 and 15 in human cerebral cortex normal aging，Alzheimer disease and Down syndrome [J]. J Neurocytol，2003，32：153-160.
[11] Kieseier BC，Pischel H，Neuen-Jacob E，et al. ADAM-10 and ADAM-17 in the inflamed human CNS [J]. Glia，2003， 42（4）：398-405.
[12] Hartmann D，de Strooper B，Serneels L，et al. The disintegrin/metalloprotease ADAM 10 is essential for Notch signalling but not for alpha-secretase activity in fibroblasts [J]. Hum Mol Genet，2002，11（21）：2615-2624.
[13] Schimmelpfeng K，Ggel S，Klmbt C. The function of leak and kuzbanian during growth cone and cell migration [J]. Mech Dev，2001，106（1-2）：25-36.
[14] Thom SR，Bhopale VM，Fisher D，et al. Delayed neuropathology after carbon monoxide poisoning is immune-mediated [J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101（37）：13 660-13 665.
[15] 孫瑞佼，郭大志，李航，等.急性一氧化碳中毒对大鼠少突胶质前体细胞的影响[J].中国康复，2015，30（1）：10-13.
[16] Wang WL，Chang YM，Jinsheng L. Expressions of the astrocytes and oligodendrocytes in rat models of delayed neuropathological sequelaeaer CO poisoning and the efect of hyperbaric oxygen treatment on the two kinds of neuroglia cell [J]. China Crit Care Med，2007，27：615-618.
[17] 郭大志，冯园，沈晨，等.一氧化碳中毒对大鼠少突胶质细胞前体细胞迁移的影响[J].中国医药导报，2016，13（36）：49-52.
[18] 李温仁，倪国坛.高压氧医学[M].上海科学技术出版社，1998：476-478.
[19] Weaver LK，Hopkins RO，Chan KJ，et al. Hyperbaric oxygenfor acute carbon monoxide poisoning [J]. N Engl J Med，2002，347（14）：1057-1067.
[20] 乔坤，谢小梅，涂超群，等.高压氧对急性一氧化碳中毒的治疗[J].中华急诊医学杂志，2006，15（7）：662-663.
[21] Juri DM，uput D，Brvar M. Hyperbaric oxygen preserves neurotrophic activity of carbon monoxide-exposed astrocytes [J]. Toxicol Lett，2016，253：1-6.