［摘要］藜芦与细辛同用，是“十八反”配伍禁忌之一。本实验采用均匀设计结合动物急性毒性实验，以动物死亡数为观测指标，探讨藜芦与细辛配伍的毒性规律。结果显示配伍后的毒性产生于藜芦和细辛的共同作用，且藜芦对配伍毒性的贡献所占权重更大，但配伍后毒性并未随藜芦用量的增加呈绝对上升趋势。
［关键词］十八反；均匀设计；藜芦；细辛；配伍禁忌；小鼠；急性毒性
［稿件编号］20111024008
［基金项目］国家重点基础研究发展计划（973）项目（2011CB505304）；国家自然科学基金项目（81073149）；北京市自然科学基金项目（7112110）
［通信作者］*高月，研究员，Tel：（010）66931312，Email：gaoyue@nic.bmi.ac.cn；*王宇光，副研究员，Tel：（010）66931225，Email：wang_yuguang@139.com
［作者简介］王艳丽，硕士研究生，Tel：（010）66931233，Email：wylhope365@163.com
细辛反藜芦是中药“十八反”的内容之一，细辛（asarum）为马兜铃科草本植物，属常用中药，毒性较大，中医有“细辛不过钱”之说；藜芦Veratrum nigrum L.为百合科藜芦属植物，根及根茎入药，有大毒。目前关于“细辛反藜芦”的研究甚少。古代文献记载藜芦与细辛药对应用者有之，如《医方考》治中风之通顶散，《普济本事方》治头风之乌头摩风膏等[1]。马代林等[2]报道，辛藜滴鼻剂（细辛与藜芦同用）对慢性鼻炎及慢性鼻窦炎有较好的疗效。细辛与藜芦到底反还是不反，药对的毒性是否与2味药的剂量配比相关联是本研究的目的。本实验采用均匀设计的方法，将2味药以不同的剂量配比，通过研究药对对小鼠的毒性作用，分析配伍后毒性变化，为十八反中藜芦与细辛相反作用的深入研究提供实验依据。
1材料
1.1动物KM种小鼠，雌雄各半，6～8周龄，体重18～22 g，由军事医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号SCXK（军）2007004。
1.2药材来源细辛产地为辽宁辽中县，藜芦产地为长春农安县，均购自安徽丰原铜陵中药饮片有限公司。由军事医学科学院马百平教授鉴定细辛为马兜铃科植物辽细辛的干燥全草，藜芦为百合科植物藜芦V. nigrum的根及根茎。
1.3仪器981B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；RE52CS型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHBⅢA循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；BS 223S型电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。
2方法
2.1药品制备[3]藜芦单煎水溶液：取藜芦饮片，称定，置于圆底烧瓶中，加入10倍量去离子水，浸泡1 h，加热回流提取1 h，滤过，滤渣中加入等量去离子水加热回流1 h，滤过，减压滤液浓缩至实验所需体积，摇匀，备用。
细辛单煎水溶液：取细辛全草，称定，置于圆底烧瓶中，加入10倍量去离子水，浸泡1 h，加热回流提取20 min，滤过，滤渣中加入等量去离子水加热回流20 min，滤过，减压滤液浓缩至实验所需体积，摇匀，备用。
细辛藜芦的合煎：取藜芦饮片、细辛全草，称定，置于圆底烧瓶中，加入10倍量去离子水，浸泡1 h，加热回流，当回流时间为40 min时，加入用10倍量去离子水浸泡1 h的细辛，再加热回流20 min，滤过，滤渣中加入等量的去离子水，加热回流30 min，滤过，减压滤液浓缩至所需体积，摇匀，备用。
2.2藜芦、细辛急性毒性评价[3]按照国家食品药品监督管理局制定的《药物非临床研究质量管理规范（GLP）》以及《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》要求，参照Bliss等方法进行小鼠急性毒性试验。在预试验的基础上，小鼠常规饲养数天适应环境后，将小鼠随机均匀分组，藜芦组共分8 组，给药剂量间距比值为0.67；细辛组共分5 组，给药剂量间距比值为0.85。小鼠禁食12 h，不禁水，0.04 mL·g-1灌胃给药，观察14 d。应用DAS 3.0版Bliss法LD50统计软件计算半数致死量（LD50）[45]。
2.3细辛藜芦配伍均匀设计方法[6]剂量的确定：根据药典规定的临床用量，折算成小鼠给药剂量，并根据急性毒性试验结果，藜芦最大剂量设为2 LD50，最小剂量设为临床最小剂量；细辛最大剂量设为0.5 LD50，最小剂量设为临床最小剂量，各按等比数列依次计算各组剂量。最终确定剂量范围：藜芦0.06～5.00 g·kg-1，细辛0.2～72.30 g·kg-1。因素与水平：采用均匀设计U7（72）表，将2味药物给药剂量作为考察因素，每个因素各取7个水平，考察因素及水平见表1。将细辛给药剂量取对数后，藜芦、细辛剂量配比见表2。
2.4 统计处理采用SAS 9.2统计软件，Mathematica 7.0软件包，对均匀实验结果作逐步回归分析及F检验。软件系统均由军事医学科学院统计教研室提供。
3 结果
3.1急性毒性实验藜芦、细辛单煎液不同浓度灌胃给药，藜芦组给药后1 min高剂量组开始出现小鼠死亡，各组小鼠死亡时间主要集中在5～10 min，中毒反应主要表现为小鼠颤抖，抽搐，痉挛，尸检肉眼下未见主要脏器有明显病变，见表3。
细辛组给药后30 min高剂量组开始有小鼠死亡，各组小鼠死亡时间主要集中在1.5～2 h，给药后20 min，小鼠自主活动减少，俯卧，反射不灵敏，眼睑闭合，肌张力降低，抽搐，约3 h后症状逐渐消失，有翻正反射，无扭体，无角弓反张和强直性抽搐，见表4。
藜芦单煎液灌胃给药小鼠的LD50（Bliss法）为2.566 g·kg-1，95%可信限为2.013～3.274 g·kg-1；细辛单煎液灌胃给药小鼠的LD50（Bliss法）为144.6 g·kg-1，95%可信限为133.9～156.1 g·kg-1。根据《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》中有关神经系统毒性描述，藜芦组小鼠表现为颤抖，抽搐，痉挛，主要毒性靶器官可能为中枢神经系统、神经肌肉；细辛组小鼠出现抽搐、死亡，主要毒性靶器官可能是中枢神经系统[78]。
3.2均匀设计实验均匀设计实验对小鼠的毒性结果见表5，利用SAS软件对实验结果进行回归分析，得到拟合回归方程为Y=0.509 23X1-0.056 98X12+0.091 19X22-0.156 43X1X2（X2为细辛给药剂量值取对数，决定系数为R2=0.988 7）。该回归方程经F检验，具有统计学意义（P＜0.05）。用Mathematics 7.0软件包计算回归方程在三维空间的分布图，见图1，小鼠的死亡率越大，表明药对的毒性越强。由图1可看出随着藜芦给药剂量的增多，小鼠的死亡率呈上升趋势，在藜芦细辛的配伍中，藜芦起主要的致毒作用。将表5中数据按照藜芦对细辛的倍数由小到大重新排列后见表6。
从表6中E，G组结果看出，配比中藜芦量大于细辛量，且藜芦用量是细辛用量3～6倍时，毒性明显。E组为藜芦对细辛倍数最高的一组，虽然藜芦的给药剂量仅约为实验中藜芦最高给药剂量的1/4，但毒性显著。藜芦与细辛配伍后的毒性不仅与藜芦的用量有关，还与藜芦在药对中所占比例有关。将细辛的用量由小到大重新排列见表7。
综合分析，配伍后毒性大小取决于藜芦和细辛的比例、藜芦的用量及细辛的用量三方面综合起作用的。
4讨论
如何遵循中药复方多途径药理作用优势，尤其是方法学的探索，是目前中医药现代化研究所关注的问题。均匀设计方法是一种新的实验方法，其特点为均匀分散，试验点数目比正交设计大幅度减少，并且其实验点有较好的代表性，是在正交设计的基础上，将数论与多元统计相结合，适用于多因素、多水平的实验设计，从理论上看，用于中药配伍组合的研究是可行的[9]。
细辛反藜芦之说，源于“十八反”歌诀。近年来有文献研究，认为细辛反藜芦不宜作为法定的配伍禁忌，对细辛藜芦药对在临床应用时应持审慎态度[10]。本实验采用均匀设计法[11]，对藜芦、细辛进行2因素7水平配比优化，发现配伍后毒性并未随藜芦用量的增加呈严格的上升趋势，毒性由藜芦和细辛共同作用，且藜芦对毒性的贡献权重更大。由表6中E，G组结果看出，当藜芦用量是细辛用量3～6倍时，毒性明显。根据药典，藜芦的临床人用最高限剂量为0.9 g，按体重60 kg计算，则人用最高限剂量为0.015 g·kg-1，折算成小鼠的用药剂量为0.18 g·kg-1，由表5中A，B组实验结果可以看出，当小鼠给药剂量为0.06，0.13 g·kg-1死亡率为0，即当藜芦给药剂量低于临床安全最高限时，藜芦与细辛合用可视为安全的。当藜芦与细辛合煎，藜芦用量为5 g·kg-1时所产生的毒性大致与藜芦单煎所产生的毒性一致。
本实验表明，均匀设计可作为研究组方配比效果的手段，用于中药的现代化研究。本实验对研究中药十八反其他药对的配伍提供实验依据。
［参考文献］
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