中药复方艾可清加味对艾滋病模型猴不同组织CD4分子表达量的干预作用


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【摘要】 目的:以艾滋病模型猴不同组织的CD4分子表达为靶点,比较艾滋病模型猴不同组织中CD4分子的表达,探讨中药复方艾可清加味对艾滋病模型猴不同组织CD4分子表达的影响。方法:通过标准方法建立艾滋病猴模型,分别设立正常对照组、模型对照组、中药组和阳性药物组。正常组不作任何处理,模型组给予生理盐水灌胃,中药组给予中药复方煎剂灌胃,阳性药物组给予替诺福韦皮下注射治疗。治疗结束后取材相关组织,用Western blot分析模型猴不同组织的CD4分子的表达。结果:艾滋病模型猴的胃、十二指肠、回肠、结肠、直肠、肠系膜淋巴结、脾、浅表淋巴结织组中CD4表达水平中药组均数值与模型组比较分别高出11.69%、10.67%、54.55%、15.31%、27.36%、22.68%、2.11%、10.75%。结论:中药复方可以有效调节艾滋病模型猴中不同组织的免疫情况,提升CD4的表达,改善免疫功能,对猴艾滋病有一定治疗作用。

【关键词】 艾滋病;CD4分子;中国恒河猴;免疫印迹;中药复方

【中图分类号】R285.5【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517(2015)10-0007-03

Intervention of traditional Chinese medicine Viagra flavored clear expression of the CD4 molecule on monkeys with AIDS in different tissues

ZHU BoqiangFU Linchun*ZHANG Miaomiao

Tropical Medicine Institute;Guangzhou University of TCM,Guang dong Guang zhou 510405

Abstract: Objective The monkey model of AIDS CD4 molecule expression in different tissues as a target, compare expression monkey model of AIDS CD4 molecules in different tissues to study the effects of traditional Chinese medicine monkey model of AIDS CD4 molecule expression in different tissues. Methods AIDS monkey model by standard methods, namely the establishment of the normal control group, model group, TCM group and positive drug group. Normal group without any treatment, the model group was given normal saline, TCM group were given traditional Chinese medicine decoction, positive drug tenofovir group was given subcutaneous treatment. Minutes after the end of treatmentrelated organizations drawn expression monkey model of CD4 molecules in different tissues analyzed by Western blot. Results AIDS model monkey stomach, duodenum, ileum, colon, rectum, mesenteric lymph nodes, spleen, lymph node tissue superficial group TCM group CD4 expression levels were higher than the value of the model group were 11.69%, 10.67%, 54.55%, 15.31%, 27.36%, 22.68%, 2.11%, 10.75%. [WTHZ]Conclusion[WTBZ] The traditional Chinese medicine can effectively regulate the immune monkey model of AIDS cases in different organizations, to enhance the expression of CD4, improve immune function, AIDS monkeys have some therapeutic effect.

Keywords: AIDS;CD4 molecule;Chinese rhesus;immunoblotting;traditional Chinese medicine

艾滋病(AIDS)全称为获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome),是人体感染人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)后,造成CD4+ T淋巴细胞数量进行性减少,引起细胞免疫功能严重缺陷,最后导致各种机会性感染、恶性肿瘤及中枢神经系统退行性变的临床综合征,严重者可导致患者死亡,严重威胁人类健康[1-2] 。人类免疫缺陷病毒(HIV)感染人体的机制中, HIV外膜gp120的第1受体是CD4分子,为HIV侵入CD4+T细胞、单核-巨噬细胞等的关键。CD4分子与gp120结合后,gp120构象发生变化,然后暴露第2受体CCR5、CXCR4的结合位点,进而激活HI外膜gp41,并插入细胞膜,最终完成病毒包膜与宿主细胞膜的融合[3] 。本文通过建立中国恒河猴艾滋病模型,在中医理论指导下采用中药复方艾可清加味进行治疗,研究不同组织中的CD4分子表达的情况及中药干预情况下不同组织中CD4分子表达变化情况,以探讨中药改善艾滋病免疫功能的可能靶点和机制,为艾滋病的防治提供新的思路和方法。

1材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1动物中国产恒河猴16只,全部为雄性。体重4~7kg,猴龄3~5岁之间,由广东灵长类实验动物中心提供,许可证编号:SCXK粤2009-0025。试验前经血清学检测SIV、猴逆转录D型病毒(SRV)、猴T淋巴细胞I型病毒(STLV-I)和B病毒抗体阴性,结核菌素阴性,痢疾菌素阴性。以蒸馏水及标准猴饲料喂饲于GLP认证的灵长类动物实验室。本实验经广东省灵长类动物实验中心动物伦理委员会批准(文件编号: K09004-IACUC),实验严格按照广东省灵长类动物实验中心标准操作/作业流程执行,并按照K09004-IACUC文件中内容给予相应的动物福利。

1.1.2感染毒株与途径SIVmac239(中国科学院昆明动物所郑永唐博士馈赠),5MID100(5个100%猴感染剂量)1ml静脉注射。

1.1.3药物在临床观察和艾滋病模型猴实验证实有效的艾可清复方[4-5] 基础上加味,具体组成如下:红参10g,黄芪20g,白术15g,茯苓10g,当归10g,藿香10g,木香6g,葛根6g,虎杖15g,毛冬青15g,黄芩10g,紫草10g,淫羊藿15g,骨碎补10g,丹参15g,炮附子6 g,甘草6g,制成浸膏,置于4℃冰箱保存备用。替诺福韦注射夜(国药准字批号:GS-1278,吉利德科学公司),4℃冰箱中保存备用。

1.1.4试剂蛋白提取液(碧云天生物);十二羟硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS,广州浩玛);二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT,Sigma);甘油(glycerol,广州浩玛);丙烯酰胺(Acrylamide,Sigma);N,N′-亚甲基丙烯酰胺(Bis-Acrylamide,Sigma);四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine,TEMED,广州浩玛);过硫酸铵(ammomium persulfate,AP,广州化学试剂厂);甘氨酸(Glycine,广州浩玛);Tris碱(Trisbase,Sigma);甲醇(methanol,广州化学试剂厂);吐温-20(Tween-20,Sigma);脱脂奶粉(BD);PVDF膜(BIO RAD);内参抗体(广州浩玛生物);CD4分子一抗(Abcam公司);HRP标记二抗(武汉博士德)。

1.1.5实验仪器超声细胞破碎仪(上海天呈科技有限公司);垂直电泳仪及转移系统(BIO RAD);射线摄影暗匣(5X7英寸,富士X光片,发光暗盒,广州浩玛生物);脱色摇床(Rotomix 公司);SW-CJ-IFD 型单人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司);5810R型低温超速离心机(德国EPPENDORE 公司);JA1203 型电子天平(上海天平仪器厂)。

1.2方法

1.2.1艾滋病猴模型制作及分组给药健康中国恒河猴16 只,随机分为正常对照组4只,艾滋病模型组12只。其中健康对照组不做任何处理,仅作为健康对照使用;艾滋病模型组以氯胺酮7mg/kg麻醉后经静脉接种SIVmac239病毒株5MID100(5个100%感染剂量)1ml制作模型,通过外周围血病毒裁量和CD4+T淋巴细胞检测确定造模是否成功。艾滋病模型组12只再分为3个亚组,其中模型组4只,给予生理盐水灌胃;中药组4 只,给予中药制成悬浮液灌胃,给药剂量为1g/(kg·d)(1g=13g生药);阳性药物组4只,替诺福韦按照30mg/kg的剂量,1次/d,皮下注射于动物背部;造模71d之后开始给药,连续给药8周,停药观察2周。实验结束后,全部动物以氯胺酮7mg/kg 麻醉后股动脉放血处死,解剖后取胃、十二指肠、回肠、结肠、直肠、肠系膜淋巴结、脾、浅表淋巴结组织分管装好,放入液氮中保存备用。

1.2.2Western 印迹分析将组织加入组织裂解液,进行组织蛋白定量;将定量裂解后的细胞样品取100μl加入5X蛋白上样缓冲液25μl,总上样量为25μg总蛋白;将样品放入沸水中8min使蛋白变性然后10000rpm离心5min;样品处理好后即可进行上样,加样量25μl;继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约0.5cm;将电泳结束后的胶片放入转印缓冲液中,将转印膜也放入转印缓冲液中浸润,进行转膜;封闭完毕后用PBST洗膜5次,每次间隔5min;加一抗,反应1.5h,洗膜5次每次间隔5min;加辣根过氧化物酶标记二抗,按说明书要求的稀释比例加入,反应1h,洗膜5次每次间隔5min;取ECL荧光底物(货号:37071,Pierce公司)A液和B液各1ml,混匀后,将PVDF膜浸泡其中,室温孵育3~5min后,用滤纸将PVDF膜表面液体擦干,并将其置于暗室,取医用X光底片覆盖,曝光1min后,依次显影、定影即可。以GAPDH (甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为内参。电泳条带经Image J 软件处理,分析各实验组条带与对照组条带面积、灰度比值。

1.2.4统计学方法采用SPSS 19.0 统计软件对实验数据进行统计学处理,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,采用多组重复测量设计资料的方差分析,若方差不齐用秩和检验,P<0.05表示有统计学意义。

3结果

与正常对照组比较,模型组各组织的CD4 表达量均有下降,下降最多的是肠淋巴结组织25.33%,下降最少的为十二指肠组织5.06%,其中回肠组织下降23.26%;与模型组比较,中药组CD4 表达量均有不同程度升高,升高最多为回肠组织,升高54.55%;同时阳性药物组CD4表达量也有一定升高。说明中药复方可以增加CD4的表达量,调理免疫功能,对艾滋病猴有一定治疗作用。详见表1。

表1艾滋病模型猴不同组织中CD4分子表达情况(单位:灰度比值)

n胃十二指肠回肠结肠直肠肠淋巴结脾浅表淋巴结

正常对照组40.91±0.000.79±0.000.86±0.000.89±0.000.87±0.000.94±0.001.11±0.000.95±0.03

模型组40.77±0.03*0.75±0.020.66±0.00*0.83±0.130.77±0.060.75±0.040.95±0.000.83±0.08

中药组40.86±0.040.83±0.071.02±0.07#0.98±0.091.06±0.030.97±0.020.97±0.030.93±0.05

阳性药物组40.92±0.05△0.77±0.080.87±0.120.94±0.091.02±0.020.87±0.01△0.91±0.030.84±0.00

注:与正常对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,*P<0.05,与中药组比较,ΔP<0.05。

4讨论

CD4分子是一类相对分子质量约为55000的单链跨膜糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族,主要表达于部分T细胞、胸腺细胞、某些B细胞和EB病毒转化的B细胞、单核-巨噬细胞以及特定区域的脑细胞表面[3] 。CD4分子能协助机体免疫系统进行免疫防御、免疫自稳和免疫监视,与众多疾病的发生发展密切相关。CD4作为一种共受体分子,通过其胞外段与MHCⅡ、TCR相互作用,形成CD4-MHCⅡ-TCR复合物,介导特异性抗原呈递;而其胞质段则通过与酪氨酸激酶P56Lck的相互作用,介导抗原信号传递,最终激活CD4+T细胞,引发一系列的免疫应答。另外,CD4自身的多聚化不仅促进与MHCⅡ、TCR的相互作用,而且增强T细胞抗原识别的特异性和敏感性[6] 。HIV病毒通过以CD4分子为第一受体,进入细胞表面表达CD4分子的T细胞、胸腺细胞、某些B细胞和EB病毒转化的B细胞、单核-巨噬细胞以及特定区域的脑细胞,进而破坏细胞,造成胞免疫功能严重缺陷,导致各种机会性感染、恶性肿瘤及中枢神经系统退行性变的临床综合征。

艾滋病在中医古典医籍中并无此病名,根据其临床表现的特点,多数医家将其归于“伏气温病”或者“虚劳”的范畴,其病机特点为本虚标实[7]。本虚即为诸脏腑气血阴阳亏虚,其中以脾肾亏虚为主,而标实主要是热毒邪气互结。因此我们认为,脾虚、肾、疫毒是艾滋病发病的主要原因,三者之间相互为患,形成邪毒伤正,正不胜邪,本虚标实夹杂证。以此为据,拟用益气健脾补肾、清热解毒中药复方治疗本病。药物由本研究所前期研究成果之一的艾可清[4-5] 和传统古方七味白术散组成。方中人参、黄芪补中益气健脾,扶正以固本;藿香、木香、葛根斡旋中焦气机,恢复脾胃升清降浊功能;虎杖、毛冬青、黄芩、紫草清热解毒以治标;淫羊藿、骨碎补、炮附子补肾温命门之火,并且能温煦脾土;丹参、当归补血活血,预防久病气滞血瘀,甘草调和诸药。免疫印迹结果显示艾滋病模型猴的胃、十二指肠、回肠、结肠、直肠、肠系膜淋巴结、脾、浅表淋巴结织组中CD4表达水平中药组均数值与模型组比较分别升高了11.69%、10.67%、54.55%、15.31%、27.36%、22.68%、2.11%、10.75%,升高最多为回肠组织,升高54.55%。综上所述,当SIV感染恒河猴发病后,CD4的表达量显著减少,导致免疫功能低下。实验结果初步表明,中药复方艾可清加味可以提升CD4的表达,从而改善免疫功能,对猴艾滋病有一定治疗作用。

参考文献

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[2] Reimann K A,Li J T,Voss G,et al.An env gene derived from a primary humanimmunodeficiency virus type 1 isolate confers high in vivo replicative capacity toa chimeric simian/human immunodeficiency virus in rhesus monkeys[J] .Journal ofvirology,1996,70(5):3198.

[3] 胡迪超,张爱华,杨晓明.人CD4分子及其治疗性抗体的研究进展[J] .中国生物制品学杂志,2010,23(8):896-900.

[4] 张苗苗,符林春,蔡卫平,等. 艾可清胶囊对HIV感染者的疗效观察[J] .中华中医药学刊,2008,27(10):2233-2236.

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[6] 崔健,肖鹤,冯健男,等. CD4分子功能表位及拮抗剂研究进展[J] .军事医学科学院院刊,2007,31(2):170-174.

[7] 张苗苗,孙世辉,符林春.以外感为经、杂病为纬辨治艾滋病[J] .广州中医药大学学报,2008,24(5):385-388.

(收稿日期:2015.02.27)