摘要[目的] 了解奶牛子宫内膜炎的病原菌感染情况与耐药现状。[方法] 随机采集库尔勒地区某牛场患子宫内膜炎奶牛的子宫黏液20份，进行实验室细菌学的分离、生化鉴定及药敏试验。[结果] 共分离出89株菌，其中链球菌45株，占50.56%；葡萄球菌24株，占26.97%；大肠杆菌13株，占14.60%；蜡样芽胞杆菌7株，占7.87%。分离出的单一菌株的检出率为80%（16/20）。引起该地区奶牛子宫内膜炎的主要病原菌是链球菌、葡萄球菌。对链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽胞杆菌这4种菌抑菌效果最好的药物依次分别为奥复星、氟苯尼考、甲氧苄啶、氟苯尼考。[结论] 该研究可为指导子宫内膜炎的临床用药和预防提供理论依据与技术支持。
关键词子宫内膜炎；分离；鉴定；药敏试验
中图分类号S875.2文献标识码A文章编号0517-6611（2014）14-04371-03
Separation， Identification and Drug Sensitivity Test of Pathogenic Bacteria of Endometritis of Dairy Cattle
MA Jianling（Korla Animal Quarantine Surveillance Station in Xinjiang， Korla， Xinjiang 841000）
Abstract[Objective] The research aimed to infection situations of pathogenic bacteria of endometritis of dairy cattle and their present drug tolerance. [Method] 20 samples of uterus mucus of dairy cattle with endometritis in a cattle farm in Korla were randomly collected to make the bacterial separation and identification in laboratory and drugsensitive test. [Result] 89 bacterial strains were isolated， including 45 strains of Streptococcus sp.（50.56%）， 24 strains of Staphylococcus aureus （26.97%）， 13 strains of Escherichia coli（14.60%） ， 7 strains of Bacillus cereus （7.87%）. The detection rate of single strain separated was 80%（16/20）. The main pathogenic bacteria that caused endometritis of dairy cattle were Streptococcus sp. and S. aureus. The drugs with the best antibacterial effect on Streptococcus sp.，S. aureus， E.coli and B. cereus were ofloxacin， florfenicol， trimethoprim and florfenicol. [Conclusion] The research could provide theoretical basis and technical support for guiding the drug administration in the clinic and prevention of endometritis.
Key wordsEndometritis； Isolation； Identification； Drugsensitive test
对目前奶牛养殖业而言，奶牛子宫内膜炎发病率一直较高，是造成奶牛繁殖障碍的主要疾病之一。在国内，成年牛子宫内膜炎平均发生率为18.97%[1]，由此引起的奶牛不孕病例可达60%～92%[2]。该病不仅影响了奶牛正常的生理功能，还能导致奶牛繁殖障碍，进而影响奶牛泌乳量，增加饲养成本和淘汰率，给养牛业造成巨大的经济损失。由于各地的病原菌存在着一定的地域性，情况有所差异，所以治疗方法有所不同。笔者研究了库尔勒地区某牛场奶牛子宫内膜炎的病原菌感染情况与耐药现状，以期为指导临床用药和预防提供理论依据与技术支持。
1材料与方法
1.1病料2013年4月在库尔勒某牛场随机选择20头具有典型临床症状的病牛。病牛阴户用温水清洗、0.2%新洁尔灭消毒后，采用直肠把握法向病牛子宫内插入灭菌输精管（1牛1换）。注入20 ml灭菌生理盐水，直肠内检手按摩片刻后回抽子宫分泌物（大多为白色，黏稠，内有絮状物）1～5 ml，注入无菌试管中，编号并密封，置于低温箱内带回检测。共采样20份。
1.2仪器与设备立式电热压力蒸汽灭菌器（LDZX50KB，上海申安医疗器械厂）、数显不锈钢电热培养箱（HPX9272MBE，上海博远实业有限公司医疗设备厂）、电热恒温鼓风干燥箱、洁净工作台、生物安全柜（BSC1100 A2）、OLYMPUS生物显微镜，输精管、试管、平皿、酒精灯、锥形瓶、玻璃棒、pH试纸、“L”棒、移液管等。
1.3培养基及生化反应管普通肉汤培养基、普通琼脂培养基、鲜血琼脂培养基；过氧化氢酶生化反应管、尿素生化反应管、枸橼酸盐生化反应管、三塘铁生化反应管、麦芽糖生化反应管、蔗糖生化反应管、甘露醇生化反应管、葡萄糖生化反应管、葡萄糖磷酸盐蛋白胨水反应管、蛋白胨水（靛基质用）反应管（以上生化管均由杭州微生物试剂有限公司生产）。
1.4药敏试验药物洁霉素（2 μg/片）、青霉素（10 μg/片）、甲氧苄啶（5 μg/片）、氨苄青霉素（10 μg/片）、氟苯尼考（75 μg/片）、奥复星（5 μg/片）、链霉素（10 μg/片）、庆大霉素（10 μg/片），以上药物均由杭州微生物试剂有限公司生产，有效期均为1年。
1.5细菌分离与培养分别用灭菌后的自制棉棒蘸取20份样品粘液均匀涂抹于普通琼脂平板上，置于37 ℃恒温培养箱中培养24～36 h后，用生理盐水冲洗，接种于普通肉汤中培养24 h，再分别划线接种于普通琼脂培养基上37 ℃培养24～36 h。根据菌落形状、颜色、湿润度、光亮度和光滑度等初步分类标记后，挑取每个菌落进行革兰氏染色，镜检，分为革兰氏阴性和阳性2种菌。
将染色镜检呈革兰氏阳性、阴性的单菌落分别划线接种于普通琼脂培养基和鲜血琼脂培养基中培养24 h，观察其生长状况。再挑取单菌落染色镜检，并进行相应的生化试验。同时挑取单菌落接种于普通肉汤中，37 ℃培养24 h后，与甘油1∶1混合后置0.5 ml离心管中，放于冰箱中低温保存。
1.6细菌的生化鉴定[3-4]
1.6.1革兰氏阴性菌的生化鉴定。分别从普通琼脂培养基和鲜血琼脂培养基上挑取革兰氏染色呈阴性的细菌接种于三铁糖培养基、枸橼酸盐培养基、葡萄糖、乳糖、过氧化氢酶、MR和VP 中进行生化试验。
1.6.2革兰氏阳性菌的生化鉴定。分别从普通琼脂培养基和鲜血琼脂培养基上挑取革兰氏染色呈阳性的细菌接种于三铁糖培养基、葡萄糖、乳糖、甘露醇、尿素、蔗糖、麦芽糖、MR、VP、过氧化氢酶和高盐肉汤中进行生化试验。
1.7药敏试验
1.7.1药敏试验方法。采用药敏纸片琼脂扩散法（Disc agar diffusion），即KirbyBarer法[5]，对病原菌进行药物敏感性试验。将保存的细菌解冻后，用移液枪吸取50 μl置于普通肉汤培养基上，37 ℃培养24 h后，吸取培养液100 μl涂布于普通琼脂培养基上，培养24 h后用灭菌生理盐水将菌苔洗掉，与麦氏比浊管进行比浊，并稀释至每毫升含有109个菌的菌液，取500 μl均匀涂布在平板上，用已灭菌的镊子将含有一定药量的药敏片平放于平板上，压实紧贴在琼脂面上。每个平板贴5张药敏片，37 ℃培养24 h，观察培养结果。
1.7.2药敏试验结果的判定。使用游标卡尺测量抑菌圈直径。根据被测定药物按常用剂量给药时在体内能达到的血药浓度，将敏感性标准分为3类：若抑菌圈直径小于10 mm为耐药；若抑菌圈直径10～18 mm，为中度敏感；若抑菌圈直径在18 mm以上，为高度敏感[6]。
2结果与分析
2.1细菌鉴定的结果细菌培养特性及镜检结果见表1。
3讨论
3.1奶牛子宫内膜炎中的病原菌正常奶牛子宫是一个相对无菌的环境，自净能力很强，只有受到强烈机械刺激、抵抗力下降和微生物感染时才会有大量微生物孽生，引起子宫内膜炎。奶牛子宫内膜炎的直接病因是病原微生物的感染，包括细菌、真菌、支原体、霉形体、病毒和寄生虫等[7]。国内外的研究表明，从子宫内膜炎病牛子宫内分离到的病原菌主要有葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、棒状杆菌、假单胞菌、变形杆菌、坏死杆菌、绿脓杆菌、生殖器杆菌、嗜血杆菌、布氏杆菌、噬血杆菌和克雷氏杆菌等。该试验表明引起该牛场奶牛子宫内膜炎的主要病原菌是链球菌和葡萄球菌，这与文献报道的基本一致[8]或不同[9]。此次奶牛子宫内膜炎分离出的单一菌株检出率高，这与王京仁[10]等的研究报道相一致。这说明此牛场奶牛子宫内膜炎单一病原菌感染占优势，两种以上病原菌混合感染占弱势。
3.2细菌的药敏试验预防和控制奶牛子宫内膜炎目前仍以抗生素为主，但应用时间较长时，致病菌容易产生耐药性。通过药敏试验可以找出对主要病原菌敏感性药物，便于临床应用。该试验结果表明，奥复星、氟苯尼考等药物对子宫内膜炎主要致病菌具有良好的抑菌效果，可作为奶牛场治疗奶牛子宫内膜炎的首选药物。常用的抗生素（如青霉素类、链霉素、庆大霉素等）己存在一定的抗药性，可能与其长期使用这些药物有关。另外在用药时建议合理配伍，不得随意加大剂量，以免产生耐药菌株。
3.3奶牛子宫内膜炎的预防由于饲养管理不当而导致各种病原微生物的感染是奶牛子宫内膜炎发生的主要原因。要更好地控制奶牛子宫内膜炎的发生，除了在治疗该病时选择比较敏感的药物外，还应采取以下措施进行综合防制：强化环境卫生和牛群的个体卫生。朱宪光等[11]报道牛体、尾、后肢和乳头细菌占全身的50%，因此要特别注意保护后肢、尾部和乳房的卫生。夏季加强通风，冬季注意保暖；运动场、牛舍和牛床尤其是产房保持清洁干燥，及时清除粪便，定期进行消毒；进行人工授精和接产过程中应严格遵守消毒程序，动作强度要适宜，做到尽量不损伤奶牛的子宫粘膜；平时加强饲料管理，合理配制饲料，给予全价日粮，以维持机体的最佳生理功能；对围产期的母牛特别注意补充各种矿物质、维生素等营养因子，产前要加强运动，增强抗病力；加强奶牛子宫内膜炎的监控，定期进行奶牛子宫内膜炎的检测，必须坚持早发现、早治疗的原则，避免延误有效的治疗时机。
感染病原微生物的种类及其所占的比例存在地域性差异，且奶牛子宫内膜炎病原菌大多为条件致病菌。因此，分离鉴定奶牛子宫内膜炎病原菌，采用药敏试验方法可以提高治疗子宫内膜炎的效率，降低医药费，又可以避免引发顽固性子宫内膜炎导致奶牛久配不孕而被迫淘汰的可能性，对有效防治奶牛子宫内膜炎具有重要意义。
参考文献
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