打开文本图片集
摘要：为了掌握郑州市奶牛隐性乳腺炎发病情况，为奶牛隐性乳腺炎病的预防提供参考依据，结合LMT检测方法进行隐性乳腺炎细菌学分析，对郑州市泌乳期960头奶牛进行细菌的分离和鉴定。结果表明，感染的细菌主要有金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌，大肠杆菌、乳房链球菌、革兰氏阳性杆菌和酵母菌等27个菌株，其中3个乳区为混合感染。结果显示，郑州市奶牛隐性乳腺炎感染普遍存在，葡萄球菌和大肠杆菌是奶牛隐性乳腺炎的主要致病菌。
关键词：奶牛；隐性乳腺炎；病原菌；分离；鉴定
中图分类号： S858.237.2+6 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）09-0254-03
奶牛养殖业是绿色、高效、节粮型养殖业，世界各国都高度重视奶牛养殖业的发展，把发展乳业作为提高国民营养水平、增强国人体质的大事来抓[1]。我国乳业随着贮运加工技术的提高和市场经济的带动，最近几年发展较快。国家有关部门为了提高国民身体素质，尤其是针对青少年和老年人的健康状况，提出改变饮食习惯的“一杯奶”工程，宣传鼓励对乳及乳制品消费，对乳业发展起到了推动作用[2-3]。虽然我国人均乳及乳制品消费与世界平均水平仍有较大差距，但在科技进步带动下，人们的认识不断提高，不断改变生活饮食习惯，使市场对乳及乳制品需求日益增长，形成巨大的市场潜力。在良好的市场环境中，我国乳业发展正快速进入品种优良化、集约化、规模化的生产进程，使奶牛产量和乳品总产量大幅提高。然而在努力加快乳业发展步伐和集约化、规模化饲养、追求高产时，疾病防治措施的相对滞后已成为主要问题。各种疾病相应增多，隐性乳腺炎在牛群中的流行更为普遍，由于隐性乳腺炎不出现乳房发热、肿胀和疼痛等临床症状，易被饲养者忽视，成为产奶量降低的主要因素[4-5]。而了解和掌握该病的发生、流行现状和致病因素是有效的防治隐性乳腺炎的主要措施，也是乳业健康发展的保障[6]。因此，为了掌握郑州市奶牛隐性乳腺炎的发病情况，2014年5月至2015年4月，抽取郑州市区不同养殖场泌乳期阳性奶牛奶样100份进行细菌学分析，为奶牛乳隐性腺炎病的防控提供理论依据，引导人们科学健康地养殖奶牛。
1 材料与方法
1.1 试验牛
2014年5月至2015年4月，对郑州市10个奶牛场随机取样共960头泌乳期奶牛奶样3 833份，用于奶牛隐性乳腺炎细菌分离和鉴定。
1.2 试验器材
奶牛隐性乳腺炎诊断液（LMT），由中国农科院兰州中兽医研究所生产，性能类似美国加州奶牛隐性乳腺炎诊断试剂（CMT）；无菌操作台1架；奥林巴斯CKX41-A32RC型显微镜；载玻片、盖玻片、血琼脂培养基、普通琼脂培养基、普通肉汤培养基、麦康凯琼脂平板培养基、培养皿、无菌试管若干、酒精灯、接种环、压力锅、恒温培养箱、电冰箱、药敏片和染色液等。
1.3 统计学方法
资料输入计算机，经核对后用SPSS 19.0统计分析软件进行统计分析，计量资料采用t检验， P<0.05时差异显著，P<0.01差异极显著。
1.4 方法
1.4.1 病原菌分离方法
1.4.1.1 奶样采集 奶样采集与LMT检测结合进行，奶牛乳房和乳头清洗消毒后，经LMT检测出现阳性乳区时，取灭菌10 mL试管采取该乳区奶样5～8 mL，采乳样时试管尽量不接触乳头，采后立即盖上管塞，对采样试管进行标号，于当日送回实验室进行病原菌分离培养。
1.4.1.2 细菌分离培养 细菌培养前，将采集好的奶样混合均匀，按照无菌操作的方法将奶样分别接种于普通琼脂培养基、普通肉汤培养基、血琼脂培养基，置于37 ℃恒温箱进行增殖培养24 h，观察培养物生长情况和菌落形态特征，并进行记录。对菌落进行涂片、火焰固定、革兰氏染色后镜检，根据培养物镜检结果，选择特征性菌落接种血琼脂培养基和普通琼脂培养基、普通肉汤培养基、麦康凯琼脂平板培养基，置恒温箱72 h 重新培养，供细菌鉴定使用[7]。
1.4.1.3 细菌涂片、革兰氏染色和镜检 火焰灼烧接种环，取少量蒸馏水于载玻片，然后取少量菌落在水中混合后涂匀，干燥后进行火焰固定，抹片上滴加草酸铵结晶紫溶液1 min水洗，加革兰氏碘液媒染1 min水洗，加95%乙醇10～30 s水洗脱色，再滴加石碳酸复红复染30 s水洗，自然干燥镜检。
1.4.2 细菌鉴定方法
1.4.2.1 细菌培养特性鉴定 将细菌接种培养基培养后，观察有无菌落生长以及菌落的形态、大小、特征、颜色等。链球菌在普通琼脂培养基上生长不良或不生长，在血琼脂上生长为细小光滑、扁平或突起、边缘整齐的白色菌落，并进行记录。肉汤接种培养后，观察肉汤透明度、浑浊程度、管底是否有沉淀物、沉淀物特征、管壁是否有附着物，是否出现菌腊膜、菌环等。在肉汤中除乳房链球菌使肉汤一致混浊外，无乳、停乳链球菌在管底形成絮状沉淀。肠杆菌在肉汤中呈均匀混浊，管底有黏性沉淀，液面管壁有菌环，然后进行记录。血琼脂培养后，除观察菌落生长情况外，重点观察其是否溶血及溶血特性[8]。α型溶血，在菌落周围形成不透明的草绿色溶血环，停乳链球菌为α溶血；β型溶血，在菌落周围形成完全透明溶血环；γ型溶血，乳房链球菌为γ型溶血，菌落周围无溶血现象。
1.4.2.2 细菌染色镜检和生化鉴定 细菌涂片后，使用革兰氏染色法染色，将染色后的涂片镜检，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色，用以区分细菌类别。染色后进行病原体镜检，主要观察细菌形态特征，根据病原菌大小、形态、有无荚膜、芽孢等特征进行细菌鉴定[9]。对经培养特性、形态学检查初步鉴定的菌株进行进一步的生化鉴定。
2 结果与分析
2.1 奶牛隐性乳腺炎LMT检测结果
在做细菌分离鉴定的同时，采用LMT检测方法的进行奶牛隐性乳腺炎的调查，在不同规模的10个奶牛场检测奶牛960头，检出LMT阳性奶牛490头，平均阳性率为51.04%。其中，阳性率最低的规模化养殖场，阳性率为30.30%，养殖小区牛场阳性率最高，达到66.67%，普通养殖场的阳性率为56.67%。检测结果表明，郑州市奶牛场乳腺炎感染较为普遍，不同奶牛场乳腺炎阳性率差异极显著（P<0.01），尤其以养殖小区最为严重。
2.2 隐性乳腺炎阳性乳区细菌检测结果
隐性乳腺炎阳性乳区细菌检测结果见表1所示，根据LMT检测基础上，共采集阳性乳区奶样100份，共有84份乳样检出细菌，检出率84.00%，其中养殖小区检出率最高，可达94.44%，普通养殖场检出率为80.00%，规模化养殖场检出率最低为75.00%。
2.3 细菌鉴定结果
由表2可知，对100份乳样进行细菌分离鉴定，共检出细菌27株，其中有3株为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和革兰氏阳性杆菌混合感染，混合感染率为11.11%。检出菌中，金黄色葡萄球菌9株，占33.33%；表皮葡萄球菌3株，占细菌总数的11.11%，凝固酶阴性葡萄球菌2株，占细菌总数的7.41%；无乳、停乳和乳房链球菌各检出3、2、1株，分别占检出细菌总数的11.11%、7.41%、3.70%；革兰氏阳性杆菌共检出2株，占7.41%；检出酵母菌1株，占总检出率的3.70%；金黄色葡萄球菌和大肠杆菌占54%，为奶牛隐性乳腺炎的主要致病菌。
2.4 不同奶牛场隐性乳腺炎感染细菌的优势菌群
在10个不同的牛场乳样中，养殖小区场检出菌19株，金黄色葡萄球菌7株、表皮葡萄球菌2株、凝固酶阴性葡萄球菌1株、链球菌4株、大肠杆菌3株、革兰氏阳性杆菌和酵母菌各1株，细菌种类较杂，其优势菌群为葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌。普通养殖场检出菌共13株，其中金黄色葡萄球菌3株、凝固酶阴性葡萄球菌2株、无乳链球菌1株、停乳链球菌2株、大肠杆菌3株、革兰氏阳性杆菌1株，其优势菌群为金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌停乳链球菌和大肠杆菌。规模化养殖场共检出菌7株，金黄色葡萄球菌3株，表皮葡萄球菌2株，无乳链球菌和大肠杆菌各1株，可见优势菌为金黄色葡萄球菌（表3）。
3 结论与讨论
奶牛乳腺炎的致病因素中，病原微生物感染是最重要的致病因素，本试验在做细菌分离鉴定的同时，采用LMT方法进行奶牛隐性乳腺炎的调查，在不同规模的10个奶牛场检测奶牛960头，检出LMT阳性奶牛490头，平均阳性率为51.04%。其中阳性率最低的规模化养殖场，阳性率为30.30%，养殖小区牛场阳性率最高，达到66.67%，说明奶牛隐性乳腺炎的发生率与饲养管理和环境卫生条件差密切相关，饲养管理和环境卫生差的养殖小区要比规模化养殖场隐性乳腺炎感染率高。
本试验通过LMT检测，在被确定为隐性乳腺炎患牛的阳性乳区，采样共100份，经细菌学分离培养，共有84份乳样检出细菌，检出率84%，其中养殖小区检出率最高，为94.44%，普通养殖场检出率为80.00%，规模化养殖场检出率最低为75%，高出国内学者的报道60%和63.48%，说明此次调查的养殖场，尤其是养殖小区应采取措施，加强饲养管理降低隐性乳腺炎的发生率。
引起隐性乳腺炎的生物性致病因素中，病原种类多达150多种，奶牛隐性乳腺炎的检测方式有很多[10]，也有人认为，隐性乳腺炎诊断是以牛奶中体细胞含量为标准判定，本试验结果可能与所取病料相关，取病料时有的奶牛因机体防御系统清除了乳腺中的病原微生物，但组织损伤尚未修复，奶中体细胞含量仍维持在较高水平，这一类隐性乳腺炎病例，奶样中检测不到细菌，也有可能有些细菌采用的分离培养方法要求比较高，无法获得细菌，也不能排除有特殊病原体感染的可能性[9-11]，还有可能是物理化学因素影响引起隐性乳腺炎的发生，所以隐性乳腺炎细菌阳性率低于LMT阳性率，这还有待于进一步研究。
本试验为细菌学鉴定，因受各种因素的影响，只能采用综合判定方法，本次试验采用兽南京农业大学陆承平编写的兽医微生物学和伯杰氏细菌鉴定手册（第八版）资料中的方法进行试验，结果表明，对100份乳样进行细菌分离鉴定，共检出细菌27株，其中有3株为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和革兰氏阳性杆菌混合感染，混合感染率为11.11%。检出菌中，金黄色葡萄球菌9株，占33.33%；表皮葡萄球菌3株，占细菌总数的11.11%，凝固酶阴性葡萄球菌2株，占细菌总数的7.41%；无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌各检出3、2、1株，分别占检出细菌总数的11.11%、7.41%、3.70%；革兰氏阳性杆菌共检出2株，占7.41%；检出酵母菌1株，占总检出率的3.70%；金黄色葡萄球菌和大肠杆菌占54%，为奶牛隐性乳腺炎的主要致病菌，这为以后隐性乳腺炎的预防提供了有力的科学依据。
奶牛隐性乳腺炎病原微生物的传播方式可分为传染性和环境性两大类，传染性病原菌主要有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌和停乳链球菌，这类菌主要经挤奶过程的各个环节通过挤奶器、挤奶工的手、擦洗乳房过程所用的毛巾、水等传播，给奶牛业造成严重损失。本次试验中分离出27株病原菌，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的检出率为较高，结果表明郑州市区奶牛隐性乳腺炎主要由传染性病原菌感染传播为主，所以在今后的隐性乳腺炎预防中要想降低奶牛隐性乳腺炎的发病率，必须在挤奶环节强化卫生消毒措施，降低病原在奶牛间的相互传播概率。
参考文献：
[1]杨正涛. 奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖模拟肽的研究[D]. 长春：吉林大学，2010.
[2]王春璈. 奶牛疾病防控治疗学[M]. 北京：中国农业出版社，2013.
[3]李静杰. 哈尔滨周边地区奶牛隐性乳腺炎的流行病学调查[J]. 养殖技术顾问，2015（1）：58.
[4]唐德琦. 奶牛隐性乳腺炎检测及其发生规律[J]. 中国畜牧兽医文摘，2014，30（7）：73，28.
[5]陈玉霞，林 峰. 3种奶牛乳腺炎主要病原菌PCR检测方法的建立[J]. 中国农学通报，2012，28（17）：105-108.
[6]孙淑霞. 我国部分地区奶牛乳腺炎流行病学调查及IRAK2基因与乳腺炎相关性分析[D]. 长春：吉林大学，2013.
[7]胡菊梅，温嘉琪，郑晓培，等. 奶牛乳房炎病原分离鉴定及其治疗方法研究[J]. 畜牧兽医杂志，2012，31（1）：16-19.
[8]Deb R，Kumar A，Chakraborty S，et al. Trends in diagnosis and control of bovine mastitis：a review[J]. Pakistan Journal of Biological Sciences，2013，16（23）：1653-1661.
[9]Jamali H，Radmehr B，Ismail S. Short communication：prevalence and antibiotic resistance of Staphylococcus aureus isolated from bovine clinical mastitis[J]. Journal of Dairy Science，2014，97（4）：2226-2230.
[10]刘长彬，钟发刚，卢春霞，等. 新疆石河子地区隐性乳房炎致病菌调查及分离鉴定[J]. 江苏农业科学，2014，42（5）：181-184.
[11]Wang P Z，Li Z D，Yu H T，et al. Elevated serum concentrations of inflammatory cytokines and chemokines in patients with haemorrhagic fever with renal syndrome[J]. The Journal of International Medical Research，2012，40（2）：648-656.