[摘要] 网状纤维染色法是病理学传统的特殊染色方法之一，在临床病理学诊断及鉴别诊断中应用广泛。病理学诊断至今仍为临床多种肿瘤性疾病明确诊断及分型等的金标准，网状纤维染色法在多种肿瘤病理诊断中发挥重要的作用。网状纤维的组织改变在临床疾病病理诊断上有重要意义，如血液系统肿瘤、乳腺纤维上皮肿瘤、胃肠道间皮瘤、神经系统肿瘤等，但网状纤维在染色过程中易出现问题，如纤维着色不良、纤维退色、染色背景过深等。本文就网状纤维染色在临床病理诊断中的应用及技术作一综述。
[关键词] 网状纤维；染色；肿瘤；病理诊断
[中图分类号] R817.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）03（c）-0072-04
[Abstract] Reticular fiber staining is one of the classical method for special staining in pathology and has been wildly used in diagnosis and differential diagnosis of various diseases. Pathological diagnosis has been regarded as the golden standard in diagnosis and classification of many tumors， in which reticular fiber staining plays important roles. The changes of reticular fiber have important implications for clinical pathological diagnosis including hematological malignancies， fibro-epithelioma of breast， gastrointestinal mesothelioma， nervous system tumors， etc. However， in the process of reticular fiber staining， there may be some problems such as fiber coloring bad， fibrous degeneration and calcification， etc. This article reviews application of reticular fiber staining and common problems in the process of staining.
[Key words] Reticular fiber； Dyeing； Tumor； Pathological diagnosis
网状纤维是网状结缔组织内的一种纤维，由网状细胞所产生。网状纤维直径为0.2～1.0 μm，纤细而有分支，穿行于网状细胞体和细胞突之间，共同构成网状支架[1]。网状纤维普通HE染色难以辨认，缺乏弹性而有韧性，化学成分是网状蛋白，是一种特殊类型的胶原蛋白，在胶原纤维上包有一层特殊的糖蛋白，使网状纤维呈现嗜银性的特点，所以网状纤维又称为嗜银纤维，从而也利用网状纤维的此种特点，用银氨液浸染后用甲醛还原使网状纤维变成黑色，从而显示网状纤维为黑色[2-3]。网状纤维分布广泛，以两种形式存在，一种作为某些器官的网状支架例如骨髓、脾、淋巴结、肝、胸腺和扁桃体等器官；另一种存在于上皮的基膜，同时平滑肌、脂肪细胞、毛细血管和神经纤维都有网状纤维包裹[4]。因此，网状纤维染色在病理诊断中的应用非常广泛，组织中网状纤维的多少和分布特点能给病理诊断提供重要的参考，纤维的粗细、疏密或有无断裂对于判断病变的性质程度及其发展与转归具有重要意义[5]。虽然近年来免疫组化等技术的应用，传统的特殊染色方法逐渐被取代，网状纤维染色的诊断价值被逐渐忽视。但网状纤维染色法作为一种传统的染色方法之一，其操作方便，价格便宜，耗材少，在许多疾病的诊断中仍发挥重要的作用，可作为病理诊断的重要手段。网状纤维染色方法很多，如Gorden-Sweets染色法、Perdrau染色法、Foot染色法、Gomori染色法、Wilder染色法等方法，而Gomori网状纤维染色是日常病理工作中最常用的网状纤维染色法[6]。该法所需时间短，易于掌握，结果稳定，但是多种因素仍然会对染色效果产生重要影响，在染色过程中若操作不当极易造成染色效果不佳[6-7]。本文将对网状纤维染色在临床病理诊断中的应用以及网状纤维的染色机制和染色过程中易出现的问题进行探讨。
1 网状纤维染色在病理诊断中的应用
网状纤维的组织改变在临床疾病病理诊断上有重要意义，特别是在协助肿瘤诊断和鉴别诊断方面具有重大意义
1.1 血液系统疾病
许多血液系统疾病的临床表现相似，最后诊断很多时候有赖于骨髓活检，骨髓形态学改变是确诊血液系统疾病的重要检查方法，而网状纤维染色的应用在多种血液病的诊断与鉴别诊断中亦有辅助作用[8-10]。网状纤维主要来源于间叶组织，血液系统属于间叶组织，同时间叶组织来源的肿瘤细胞本身即可产生网状纤维，实验结果[11]表明，在急性淋巴细胞性白血病（ALL）、急性髓细胞性白血病（AML）、多发性骨髓瘤（MM）、再生障碍性贫血（AA）、特发性血小板减少性紫癜（ITP）、骨髓增生异常综合征（MDS）、原发性骨髓纤维化（PMF）、原发性血小板增多症（ET）、骨髓转移癌（BMT）等血液系统疾病中，网状纤维阳性检出率和/或网状纤维密度结果具有明显差异性，从而使网状纤维染色在鉴别多种血液系统疾病中起到了重要作用。结果显示，在以上血液系统疾病中，PMF阳性率最高，依次为BMT、MM、ET、ALL、MDS、AML、ITP、AA网状纤维阳性率最低。由于网状纤维可以由间叶肿瘤细胞产生，所以非肿瘤性血液系统疾病中网状纤维产生较少，阳性率普遍偏低，最高者为增生性贫血，而ITP、AA网状纤维阳性率最低。而网状纤维密度结果显示，密度为（+）者往往为良性血液病，无恶性血液系统疾病，如AA、ITP；结果≥（++）见于恶性血液系统疾病，如MDS、ALL、AML、MM、PMF以及BMT，其中PMF和BMT最高；结果≥（+++）者，良性血液病无，最高为PMF和BMT。同时结果也显示ALL与AML、MM网状纤维阳性率以及密度均有显著差异。综上所述在血液系统疾病的鉴别诊断中，网状纤维染色也可以作为很好的参考指标用于血液系统疾病的诊断。如患者临床表现为外周血红细胞、血小板、白细胞减少，骨髓增生不良，可考虑为MDS或者是AA，通过网状纤维染色，如果网状纤维增多，密度≥（++），可以首先考虑MDS[12]。ALL与AML依靠形态学有时不易区分，通过网状纤维染色，如网状纤维增多首先考虑ALL。
1.2 乳腺纤维上皮肿瘤
最常见的乳腺纤维上皮性肿瘤包括乳腺纤维腺瘤和乳腺分叶状肿瘤。乳腺纤维腺瘤是由乳腺上皮和纤维组织包括胶原纤维、网状纤维和弹力纤维按不同比例增生构成；乳腺分叶状肿瘤分为良性和恶性，良性和恶性之间纤维含量的丰富程度不同，但基本组织结构与乳腺纤维腺瘤相似，也是由乳腺上皮和3种纤维组织构成，而间质的纤维成分的差异可以成为鉴别以上疾病的依据[13]。乳腺纤维腺瘤导管周围碱质中胶原纤维垂直于导管基底部而分叶状肿瘤中胶原的胶原纤维系平行于导管周围，两者胶原纤维分布存在明显差异。乳腺纤维上皮性肿瘤组织中均可发现在导管上皮的基膜处有完整的网状纤维分布，而间质中基本上均未见有网状纤维成分，两者网状纤维分布无明显差异。而乳腺纤维腺瘤，弹力纤维分布在血管壁周围，由于乳腺分叶状肿瘤缺乏瘤周包膜，因而也因血管稀少而缺乏弹力纤维。所以缺乏弹力纤维[13-15]。所以，结合胶原纤维、网状纤维和弹力纤维的组合染色结果，为诊断乳腺纤维上皮性肿瘤提供依据。
1.3 胃肠道间质瘤
来源于胃肠道以梭形细胞为主的间叶源性肿瘤如平滑肌瘤、神经鞘瘤与梭形细胞型间质瘤在形态相似的情况下，采用网状纤维染色，结果显示平滑肌瘤瘤细胞间可见大量网状纤维呈密集、束状交叉排列，网状纤维与瘤细胞平行走向[16]。神经鞘瘤网状纤维与瘤细胞平行分布，不包绕瘤细胞，穿行于在瘤细胞之间呈波浪状排列。而间质瘤瘤细胞之间可见大量呈疏松排列的网状纤维，几乎存在于每一个瘤细胞间并包绕瘤细胞，分布均匀，呈“蜘蛛网”样分布。以上3种差异显著的网状纤维形态以及分布特征，对鉴别来源不同、但形态相似的胃肠道梭形细胞肿瘤具有临床价值[17-19]。
1.4 垂体疾病
垂体是人体重要的内分泌器官，其构成分为腺垂体和神经垂体两部分。腺垂体远侧部由腺细胞构成，腺细胞排列成索状、巢状或腺样结构，细胞之间具有丰富的窦状毛细血管和网状纤维等少量结缔组织，网状纤维染色可以清楚显示腺泡和细胞索轮廓[20]。在垂体病变中，网状纤维的形态和分布、增多或减少、断裂或崩解等组织表变可能为垂体疾病的诊断和鉴别诊断提供有效的医学诊断方式。垂体腺瘤是常见的垂体病变，通过网状纤维染色发现在腺瘤内缺乏网状纤维，并且通过网状纤维可以辨别腺瘤和正常垂体组织的界限，同时发现肿瘤周围的正常垂体组织内网状纤维因腺瘤的压迫而变得致密。垂体卒中是大的垂体腺瘤发生内出血或者各种原因导致的梗塞使垂体短期之内体积迅速增大，通过HE染色，可见大片坏死以及出血病灶，缺乏特征性改变也无特异性检测方法，而网状纤维染色可以勾勒出腺瘤的轮廓，可以为垂体卒中的诊断提供依据。垂体的微腺瘤（直径小于10 mm的垂体腺瘤）是亚临床垂体腺瘤，发生率高，常见表现形式为Rathke囊肿合并微腺瘤[21]，临床Rathke囊肿切除标本，基本带有正常垂体组织，由于组织小，难以判断是否合并有微腺瘤，腺瘤内无网状纤维而正常垂体组织含有网状纤维，因此通过网状纤维染色可以判断这种较常见的Rathke囊肿合并腺瘤。另外垂体增生，特别是垂体结节状再生与垂体腺瘤在临床症状、内分泌学检查结果以及影像学检查方面不易区分[22]，通过网状纤维染色，可以发现垂体增生腺泡扩大，网状纤维支架机构完整，而垂体腺瘤内的网状支架破坏[23]。综上所述，网状纤维染色在垂体疾病，特别是垂体腺瘤的诊断和鉴别诊断中可以作为一种方便、实用的诊断方法。
1.5 其他
实验性肝纤维化成过程中，通过对网状纤维进行动态染色，结果提示实验用大鼠肝纤维化形成的不同阶段，网状纤维呈现出不同的特点，由此提示网状纤维染色对判断肝纤维化的形成具有一定参考价值[19]。有研究表明，癌巢周围的网状纤维形态可以反映出癌的生长和浸润速度及机体的反应。例如鼻咽癌癌巢周围网状纤维崩毁，提示癌组织在扩展；如有网状纤维包裹，则提示癌组织生长缓慢，预后较好[1]。在中枢系统疾病中，脑膜瘤病理形态多样，组织类型多，容易与多种形态相似肿瘤混淆，特别是脑内脑膜瘤易与胶质瘤混淆，网状纤维染色具有鉴别作用，前者富于网状纤维而后者则无网状纤维。在血管内皮瘤和血管外皮瘤、骨恶性淋巴瘤和尤文肉瘤等疾病的鉴别中，网状纤维染色也起到了重要作用[24]，本文不再详细阐述。
2 网状纤维染色技术探讨
北京卫生职业学院（以下简称“我院”）病理检验技术教学和临床病理实验室网状纤维染色常用Gomori法，一般需经过氧化、漂白、媒染、浸银、还原、调色、固定几个步骤完成。该法易受多种因素影响，若在染色过程中不注意染色细节，易造成组织切片染色效果不佳。以下本文将对染色过程中易出现的问题及应注意的细节进行探讨。
2.1 高锰酸钾氧化
高锰酸钾氧化可使网状纤维内糖蛋白中己糖毗邻的羟基转变为醛基，使网状纤维的染色选择性增强从而使网状纤维突出显示。单纯使用高锰酸钾也能氧化但速度慢，如果经过浓硫酸酸化可加强高锰酸钾的氧化作用，同时也能减弱细胞核对银氨液的反应，使银浸染均匀一致，改善背景色调，利于后续胞核复染，从而改善染色效果。同时氧化的时间也是关键，一般为3～5 min。目前，我院病理检验技术教学和临床病理实验室酸化高锰酸钾（5%）氧化时间为3 min，效果较好，经氧化后的切片呈现棕色。本步骤中高锰酸钾和硫酸应等份混合，两液分瓶盛装放于4℃冰箱保存，临用时放置室温方可混合使用。高锰酸钾常规使用浓度为5%，也有使用浓度为0.25%高锰酸钾，染色效果较好[25]，可在今后的实际工作中加以摸索。
2.2 草酸漂白
由于草酸具有还原性，可使经过高锰酸钾氧化过的组织切片洗脱，使切片无色。草酸漂白的时间一般为1～2 min，但实际操作要以切片呈白色为度，漂白过度切片容易脱落，而漂白不足则不利于之后与银的结合。文献显示[5]用1%过碘酸作为氧化剂，氧化4～5 min，可替代高锰酸钾氧化和草酸漂白作用。本法可在今后的实际工作中加以实践摸索。
2.3硫酸铁铵媒染
媒染又称为感应，可以提高网状纤维对银盐的亲和力，使氨银更易沉积在网状纤维上，提高网状纤维和背景的对比度，所以媒染时间必须充足，一般为5～15 min，媒染时间不足，将导致网状纤维染色不良。我院病理检验技术教学和临床病理实验室目前媒染时间为10 min。
2.4 浸银
浸银后银氨液中的二氨合银离子[Ag（NH3）2+]与醛基结合，再经甲醛液作用还原为黑色的金属银，从而使网状纤维呈黑色。氨银溶液的配制以及氨银液染色时间是关键。配制氨银溶液时，玻璃器皿必须十分清洁，而且需用双蒸水，禁用自来水。配制好的溶液应放置于棕色玻璃瓶中4℃冰箱保存，使用时间为4～8周。浸银时间为30 s至数分钟，最佳时间应根据实际实验环境进行摸索确定，目前我院病理检验技术教学和临床病理实验室的浸银时间为1 min。
2.5 甲醛的还原作用
甲醛是还原剂，能把结合在网状纤维上的氨银络合物还原成棕黑色的金属银镀在网状纤维表面。甲醛的还原时间要严格控制不能过短也不能过长，否则染色效果不佳。
2.6 氯化金的调色作用
组织经银氨液浸染及甲醛还原后，经氯化金作用可使多余的银生成单质金和白色的氯化银沉淀，从而减少污染。调色时间一般为1～2 min，最好在显微镜下进行，时间过长会引起纤维退色现象。
2.7 硫代硫酸钠的固定作用
硫代硫酸钠能清除未被甲醛还原和未与氯化金作用的银，使切片着色固定清晰持久。
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（收稿日期：2015-12-15 本文编辑：任 念）