[摘要] 目的 研究黑青稞籽皮提取物对小鼠耐缺氧及抗疲劳能力的影响。 方法 采用小鼠动物实验，分别研究黑青稞籽皮提取物对常压耐缺氧、亚硝酸钠中毒、急性脑缺血小鼠存活时间的影响以及通过对异丙肾上腺素增加心肌耗氧、失血性休克小鼠心搏时间的影响的观察评价其耐缺氧。利用负重游泳实验评价其抗疲劳功能。 结果 与生理盐水组比较，黑青稞籽皮提取物在3.5 g/kg剂量条件下显著延长常压耐缺氧小鼠的存活时间（P < 0.01），在4.0 g/kg剂量条件下能够有效延长断头小鼠喘气时间（P < 0.05），在2.0 g/kg剂量条件下能够延长小鼠负重游泳时间（P < 0.05）。 结论 黑青稞籽皮提取物具有提高小鼠耐缺氧及抗疲劳能力的作用。
[关键词] 黑青稞；籽皮提取物；耐缺氧；抗疲劳；小鼠
[中图分类号] R284 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）10（a）-0007-04
Preliminary study of black barley pericarp extract on the ability of anti-hypoxia and anti-fatigue of mice
HE Min1 WANG Qingjun2 DING Xuejie1 LI Weijing1 REN Suping1 APei·Renpeng3 GUO Yan3 XUE Ping4 WANG Xuanlin1 YU Qun1
1.Beijing Institute of Transfusion Medicine， Beijing 100850， China； 2.Shenzhou Biological & Technology Co.， Ltd.， Inner Monggol Autonomous Region， Huhhot 010206， China； 3.Tibet Fanye Feihong Technology Co.， Ltd.， Tibet Autonomous Region， Lhasa 850001， China； 4.The 305th Hospital of People"s Liberation Army， Beijing 100017， China
[Abstract] Objective To study the effects of black barley pericarp extract on the ability of anti-hypoxia and anti-fatigue of mice. Methods The effects of black barley pericarp extract on survival time of mice with anoxia endurance under normal pressure， sodium nitrite poisoning， acute cerebral ischemia. Injecting isoprenaline and hemorrhagic shock were used to assess the function of anoxia endurance， tests of burdened swimming were used to assess the function ofanti-fatigue. Results Compared with normal saline group， the black barley pericarp extract significantly prolonged the survival time of mice under hypoxia condition with 3.5 g/kg dose （P < 0.01）， and effectively prolonged gasp time of beheaded mice with 4.0 g/kg dose （P < 0.05）， and prolonged the swimming time of mice by the extract of black barley pericarp with 2.0 g/kg dose （P < 0.05）. Conclusion Black barley pericarp extract can enhance the function of anti-fatigue and anoxiaendurancein mice.
[Key words] Black barley； Pericarp extract； Anoxia endurance； Anti-fatigue； Mice
青稞（Hordeumvulgare ssp.vulgare）是一种生长在高原低温低氧环境中的农作物，又称裸大麦，是禾本科大麦属作物，在世界许多国家和地区作为主要粮食作物已有几千年历史。在西藏，青稞品种资源很丰富，不同颜色、不同形状的品种多达十几个，有时在同一地区能发现7～8个青稞品种。青稞分为白青稞、黑青稞、墨绿色青稞等种类，其中，黑青稞是西藏特有品种，喜马拉雅山北麓的山南地区措美县因气候、土壤特殊而盛产黑青稞，将其加工成糌粑后口感好，营养价值高，而且长期服用对治疗糖尿病、胃病等有明显的疗效，这是白青稞不具备的。黑青稞表皮中含有丰富花色苷，黄酮及类黄酮等物质，药理学研究表明，花色苷具有抗氧化、抗炎、降血脂、抑制肿瘤生成等生物学活性[1]。目前自然界已知的花色苷有20种以上，常见的主要有6种：矢车菊色素、天竺葵色素、飞燕草色素、芍药色素、牵牛花色素和锦葵色素[2]，有5种糖分子参与构成花色苷的糖基部分，分别为葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖[3]。Bakowska等[4]研究证明：花色苷是迄今为止所发现的最有效的天然水溶性自由基清除剂，其淬灭自由基的能力是维生素C的20倍，维生素E的50倍。花色苷可增强人的视力[5]、预防心脑血管疾病[6]和防治肿瘤等作用[7]，近年来的研究发现，矢车菊-3-氧-β-D-葡萄糖苷具有对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用[8]。笔者依据黑青稞生长环境及其籽皮所含天然物质，推测黑青稞籽皮提取物具有提高缺氧耐受力和抗疲劳能力的功效，本研究采用小鼠动物药效学实验进行验证，旨在为提供安全、绿色、低成本的食物原料来源作为耐缺氧保健品的开发资源提供可靠的实验依据。
1 材料与方法
1.1 样品
黑青稞原料由西藏蕃业飞虹科技有限公司提供；黑青稞籽皮提取物（由军事医学科学院野战输血研究所提供）。
1.2 实验动物
由北京维通利华实验动物技术有限公司提供的SPF级健康昆明种小鼠200只，雄性，体重18～22 g，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2012-0001。
1.3 主要仪器与试剂
仪器：动物天平、分析天平、游泳箱、振荡器、秒表等。
试剂：钠石灰、生理盐水、凡士林、亚硝酸钠、异丙肾上腺素等。
1.4 方法
1.4.1 黑青稞籽皮提取物浸提工艺 黑青稞籽皮→50%乙醇浸提（条件：0.2%柠檬酸调pH 2；53℃水浴3 h；溶剂：料10∶1）→醇提液→减压回收→提取物→常温干燥。
1.4.2 常压耐缺氧实验 小鼠随机分为三组，每组10只，第一组以3.5 g/（kg·d）剂量灌胃给予黑青稞籽皮提取物（高剂量组），第二组以1.75g/（kg·d）剂量灌胃给予受试物（低剂量组），第三组灌胃给予同样体积[0.2 mL·/（kg·d）]的蒸馏水（生理盐水组），连续灌胃7 d。末次灌胃30 min后将小鼠放入200 mL磨口广口瓶中，密封（瓶内放钠石灰10 g以吸收O2，垫滤纸以吸收尿液，广口瓶用前盛水校正容量，每瓶放1只小鼠），以呼吸停止为指标，记录小鼠存活时间。
1.4.3 亚硝酸钠中毒实验 小鼠随机分为三组，每组10只，第一组以4.0 g/kg剂量腹腔注射黑青稞籽皮提取物（高剂量组），第二组以2.0 g/kg的剂量腹腔注射受试物（低剂量组），第三组腹腔注射生理盐水0.02 mL/g（生理盐水组）。10 min后，两组均注射2%亚硝酸钠溶液，剂量为0.02 mL/g。记录小鼠死亡时间。
1.4.4 急性脑缺血实验 小鼠随机分为两组，每组10只，第一组以4.0 g/kg剂量腹腔注射黑青稞籽皮提取物水溶液（高剂量组），第二组以2.0 g/kg剂量腹腔注射受试物（低剂量组），第三组腹腔注射生理盐水0.02 mL/g（生理盐水组）。10 min后，不需麻醉，用大剪刀在耳下部快速断头，记录喘气时间。
1.4.5 异丙肾上腺素增加心肌耗氧实验 小鼠随机分为四组，每组10只，第一组按照0.015 mg/g剂量给小鼠皮下注射盐酸异丙肾上腺素5 min后，以4.0 g/kg剂量腹腔注射黑青稞籽皮提取物（高剂量组）。第二组按照0.015 mg/g的剂量给小鼠皮下注射盐酸异丙肾上腺素5 min后，以2.0 g/kg剂量腹腔注射黑青稞籽皮提取物（低剂量组）。第三组按照0.03 mL/g剂量给小鼠皮下注射生理盐水5 min后，按照0.02 mL/g剂量给小鼠腹腔注射生理盐水（生理盐水组），第四组按0.015 mg/g剂量给小鼠皮下注射盐酸异丙肾上腺素5 min后，按照0.02 mL/g剂量给小鼠腹腔注射生理盐水（模型组）。上述四组小鼠处理10 min后，分别放入200 mL磨口广口瓶内，密封。记录小鼠存活时间。
1.4.6 对失血性休克小鼠心搏时间的影响实验 小鼠随机分为三组，每组10只，第一组按照4.0 g/kg腹腔注射黑青稞籽皮提取物（高剂量组），第二组按照2.0 g/kg腹腔注射黑青稞籽皮提取物（低剂量组），第三组腹腔注射0.02 mL/g生理盐水（生理盐水组）。10 min后，不需麻醉，迅速断头，并剪开胸皮及胸骨，打开胸腔，暴露心脏，以心室停跳为指标，记录小鼠的心搏时间。
1.4.7 小鼠负重游泳实验 小鼠随机分为三组，每组10只，第一组以3.5 g/（kg·d）剂量灌胃给予黑青稞籽皮提取物（高剂量组），第二组以1.75 g/（kg·d）剂量灌胃给予受试物（低剂量组），第三组为对照组，灌胃给予同样体积[0.2 mL/（kg·d）]的蒸馏水（生理盐水组），连续灌胃7 d。末次给药1 h后，在每只小鼠尾部加体重10%的负荷，放置于水温（26±1）℃，水深20 cm的游泳槽内，观察小鼠的游泳时间，以小鼠沉到水底6 d内不再游出水面为止。
1.5 统计学方法
采用统计软件SPSS 16.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验。计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1常压耐缺氧实验
黑青稞籽皮提取物3.5 g/kg剂量组小鼠存活时间较生理盐水组显著延长，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。
表1 黑青稞籽皮提取物对小鼠缺氧的影响（x±s）
注：与生理盐水组比较，**P < 0.01
2.2亚硝酸钠中毒实验
黑青稞籽皮提取物在所用剂量下未显现出延长亚硝酸钠中毒小鼠存活时间的作用。见表2。
表2 黑青稞籽皮提取物对小鼠亚硝酸钠中毒的影响（x±s）
2.3对小鼠急性脑缺血的影响
结果显示，黑青稞籽皮提取物在高、低剂量下均能显著延长急性断头小鼠喘气时间，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表3。
表3 黑青稞籽皮提取物对小鼠急性脑缺血的影响（x±s）
注：与生理盐水组比较，*P < 0.05
2.4 异丙肾上腺素对心肌耗氧的影响
黑青稞籽皮提取物在高、低剂量下未显现出心肌耗氧的改善作用。见表4。
表4 黑青稞籽皮提取物对异丙肾上腺素增加小鼠心肌耗氧的影响（x±s）
2.5 对失血性休克小鼠心搏时间的影响
黑青稞籽皮提取物在所用剂量下对失血性休克小鼠心搏时间未显现出延长作用。见表5。
表5 黑青稞籽皮提取物对失血性休克小鼠心搏时间的影响（x±s）
2.6小鼠负重游泳实验
黑青稞籽皮提取物在高剂量条件下有效延长小鼠负重游泳时间，差异有统计学意义（P < 0.05），提示其具有抗疲劳能力。见表6。
表6 黑青稞籽皮提取物对小鼠负重游泳时间的影响（x±s）
注：与生理盐水组比较，*P < 0.05
3 讨论
通过黑青稞籽皮提取物对小鼠耐缺氧及抗疲劳能力影响的动物实验，笔者得到了如下的结论并进行了分析：①小鼠在密闭容器中受缺氧因素损害，主要反映在心和脑缺氧。由于常压耐缺氧为非特异性缺氧，数据显示黑青稞籽皮提取物显著延长了小鼠的存活时间，说明对脑缺氧或心肌缺血有改善作用。②在断头实验中，脑血液供应中断，但脑中原有的血和营养物质尚能使脑功能维持一段时间，表现在小鼠规律地喘气，实验数据反映出黑青稞籽皮提取物明显延长小鼠的喘气时间，能够使脑耗能减少，对断头脑缺氧有保护作用。③在亚硝酸钠致小鼠全身组织中毒性缺氧实验、对抗异丙肾上腺素引起的心肌耗氧增加所致心肌缺血实验、失血性休克小鼠心搏时间的影响实验中，黑青稞籽皮提取物未显示出缓解或改善作用。黑青稞籽皮提取物显示有效延长小鼠负重游泳时间的作用，显示出提高抗疲劳能力的作用。
缺氧对机体是一种紧张性刺激，影响机体各种代谢，特别是影响机体的氧化供能，最终会导致机体的心、脑等重要器官缺氧或损伤，引起氧供应能力不足而死亡[9-10]，高原低压性缺氧干扰机体正常的氧化反应，造成细胞代谢和功能的紊乱，从而对机体的组织、器官产生损害。脑是机体主要的耗氧器官，具有较高的脂质容量和较低的抗氧化储备能力，对高原急性低压缺氧损害具有很高的敏感性[10]。目前，红景天是应用最为广泛的天然药物资源，红景天生长环境特殊，生长周期长，脆弱的生态环境很容易破坏，有部分人工种植和移栽研究，但规模化种植未见报道[11]。为了解决资源的可持续利用，学者们都在不断寻找防治高原缺氧的天然植物，以期替代红景天这一珍贵药用资源[12-15]。本实验用小鼠药效学证明了黑青稞提取物对急性脑缺氧具有显著的保护作用，提高小鼠耐缺氧能力，具备开发为耐缺氧保健食品的潜力。
经军事医学科学院仪器测试分析中心高效液相色谱检测，黑青稞籽皮提取中物总花色苷含量占籽皮提取物的7.6%，主要存在的天然花色苷物质为氯化花翠素（含量为5.7%）。目前，花色苷对心肌细胞缺氧保护作用的研究热点是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷[16]，对氯化花翠素的耐缺氧作用研究较少。缺氧导致机体抗氧化能力下降，各种酶系统与非酶系统会产生大量活性氧（ROS），ROS攻击生物膜中的酶和不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，形成以丙二醛为主的多种过氧化物[17]。笔者的前期工作证明了黑青稞籽皮提取物通过保护线粒体跨膜电位，抑制了活性氧产生，从而减少了活性氧对心肌细胞的损伤作用。由于黑青稞籽皮提取物中主要活性物质为类黄酮，因此笔者将进一步分离、纯化并进行相关细胞学验证，以期明晰黑青稞籽皮提取物耐缺氧的功效成分是有效部位还是单一成分，为黑青稞的耐缺氧保健功能食品的开发奠定实验基础。
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（收稿日期：2014-06-16 本文编辑：卫 轲）