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摘 要 甘蔗环斑病是甘蔗较为常见的一种真菌性病害。针对海南昌江十月田甘蔗种植地出现一种严重危害疑似环斑病的叶斑病，本文通过对其病原菌的形态学特征观察，并结合ITS序列系统聚类分析，将叶斑病病菌鉴定为引起环斑病的甘蔗小球腔菌Leptosphaeria sacchari。生物学特性分析结果表明：适宜该菌生长的温度为13～30 ℃，最适温度为 25 ℃；适宜菌丝体生长的pH为4～11，最适pH为5，全黑暗有利于菌丝体的生长；适宜生长的碳源为麦芽糖和葡萄糖、氮源为硝酸钠和L-丝氨酸。采用生长速率法对6种杀菌剂敏感性进行了测定，结果揭示咪鲜胺、丙环唑、多菌灵、腈菌唑等4种药剂对甘蔗环斑病菌具有显著的抑制效果，其EC50值分别为0.397 6、2.251 9、2.163 4、4.827 3 μg/mL。
关键词 甘蔗环斑病；小球腔菌；生物学特性
中图分类号 S435.661 文献标识码 A
甘蔗环斑病（Sugarcane ring spot）又名轮斑病，是甘蔗上较常见的一种真菌性病害。自1890年印度尼西亚爪哇首次报道该病以来，迄今几乎所有植蔗国家都有发生。此病多危害糖蔗老叶，当条件适宜时，也可为害叶鞘和蔗茎。严重时，该病使叶片提早枯死，直接影响甘蔗的产量与含糖量。此外，环斑病也能危害果蔗，且该病在果蔗上具有感病快、传染快，连作地易发病等特点[1]。目前该病在中国蔗区普遍发生[2-8]。然而，针对此病的相关研究比较少。目前关于甘蔗环斑病的研究仅限于病害调查及大田防控试验。贵州果蔗病害重灾区的调查结果表明，环斑病是危害果蔗的主要病害之一，该病可导致果蔗的產量和品质受到严重影响[9]；李向勇与易代勇则对黔糖3号环斑病作了田间药效防控试验[9]。
2015年7月本课题组在对海南甘蔗种植区进行病害调查时发现，海南昌江十月田甘蔗种植地出现一种疑似甘蔗环斑病的叶斑病，严重影响其甘蔗产量。为了明确其病原菌，以及掌握该病的发生与流行条件，本研究对采集的典型病样进行了分离与鉴定，并进一步对其生物学特性分析和防治药剂的筛选，以期为掌握该病的病菌流行规律以及预测预报奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试样品 病叶样品采自海南昌江十月田甘蔗种植地。
1.1.2 供试培养基 供试马铃薯葡萄糖（Potato Dextrose Agar，PDA）培养基按如下配方进行配制：马铃薯200 g、葡萄糖16 g、琼脂粉20 g、蒸馏水定容至1 000 mL；而Czapek基础培养基配制为：硝酸钠2.00 g、磷酸二氢钾1.00 g、氯化钾0.50 g、七水硫酸镁0.50 g、硫酸铁0.01 g、蔗糖30.00 g、琼脂粉20 g、蒸馏水定容至1 000 mL。上述培养基均于121 ℃高压灭菌20 min后备用。
1.1.3 试剂、引物及菌株 真菌DNA小量提取试剂盒购自OMEGA公司。rDNA-ITS通用引物ITS1/ ITS4序列[10]，由英潍捷基（上海）贸易有限公司采用普通脱盐方式合成；大肠杆菌Trans-T1感受态细胞由北京全式金生物技术有限公司提供，其它试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 病原菌的分离与形态观察 利用常规组织分离法，对具有典型症状的甘蔗叶片进行病原菌分离培养。记录病原菌在PDA培养基上的菌落形态与菌丝体颜色，并于显微镜下对分生孢子器及分生孢子的形态、颜色、大小等进行观察。
1.2.2 病原菌致病性测定 利用柯赫氏法对分离物进行致病性测定。将分离物在PDA培养基上预培养6 d左右。采用菌饼法，利用健康新台糖22号甘蔗离体叶片接种，保湿，5 d后观察其是否发病，并从病部对病原菌进行再分离，观察所分离物是否与原分离物的形态特征一致。
1.2.3 基于r DNA-ITS 区序列的病原菌分子鉴定
病原菌基因组总DNA的提取参照OMEGA真菌DNA小量提取说明书进行提取。利用引物ITS1/ ITS4对病原菌基因组总DNA为模板进行PCR扩增。PCR产物回收采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TaKaRa），按试剂盒说明书进行操作。取4 μL回收产物与pEASYTM Cloning Vector连接，转化大肠杆菌感受态细胞，经蓝白斑筛选后，选取3个阳性克隆子送英潍捷基（广州）贸易有限公司测序。
1.2.4 rDNA-ITS序列比对分析 将测序得到的rDNA-ITS序列经两端去载体序列后，于GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行BLAST比对及同源序列分析，并利用MEGA 4.0软件中邻接法 （neighbor-joining，NJ）进行聚类分析，绘制出相应的系统发育树。
1.2.5 病原菌生物学特性分析
（1）不同温度下菌落生长速率测定。以马铃薯葡萄糖培养基为基础培养基，接种菌丝块（5 mm，下同），分别于5、13、20、25、28、30、37 ℃等7个梯度温度培养。培养6 d后，用十字交叉法测量菌落直径。重复3次，下同。
（2）不同酸碱度下菌落生长速率测定。以1为梯度，分别将已灭菌的培养基调节为pH4.0至pH11，迅速倒制平板。冷却后，接种菌丝块，25 ℃恒温培养箱中培养，6 d后测量菌落直径（重复3次；下同）。
（3）光照对菌落生长的影响。将直径为5 mm的菌丝块接种于PDA平板中央，分别置于全日光照、12 h光照/12 h黑暗、全日黑暗等3种条件下培养。
（4）不同碳源对病原菌生长的影响。以固体Czapek培养基为基础，分别以等量的蔗糖（20 g）、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、D-木糖、和D-半乳糖作为碳源，配制成不同碳素营养的培养基。接种菌丝块，25 ℃恒温培养箱中培养，6 d后测量菌落直径。
（5）不同氮源对病原菌生长的影响。以固体Czapek培养基为基础，对供试硝酸钠、L-精氨酸、L-丝氨酸、甘氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸等其氮素均折算为0.329 4 g/L纯氮素进行配制，配制成不同氮素营养的培养基，备用。
1.2.6 不同药剂对甘蔗环斑病菌敏感性测定
采用生长速率法测定甘蔗环斑病菌对6种杀菌剂的敏感性（表1）。将甘蔗环斑病菌在PDA培养基上25 ℃预培养6 d。于菌落边缘打取菌饼（内径5 mm），后将菌饼分别接入含药平板中央，每处理设3次重复。25 ℃恒温培养箱中培养6 d后，采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率。根据生物统计机率值换算表，将抑制百分率换算成抑制机率值。以处理浓度（mg/L）的对数值为横坐标，相应抑制机率值为纵坐标求出毒力回归方程，并求出抑制中浓度EC50、EC95和相关系数（r）。
2 结果与分析
2.1 病原菌的分离与形态特征
甘蔗环斑病主要侵染老叶，有时也会危害嫩叶、叶鞘以及蔗茎。叶片被危害时，呈墨绿色至褐色，长卵圆形，病斑具有轮廓分明的淡黄色边缘，中心为枯白色或草黄色，有时整个病斑保持红色或红褐色（图1-A、B）。于田间采集典型病叶带回实验室分离，经单孢分离获得菌株，编号为SL10。病原菌在PDA培养基上的菌落呈圆形、边缘整齐；菌丝体白色后期变灰色、生长旺盛，棉絮状，中部稍隆起，菌落背面呈淡青色（图2）。分生孢子器扁球形，黑色；分生孢子初无色，老熟时淡褐色，单胞，大小为2.713～8.395 μm-1.432～5.010 μm（随机测量100个分生孢子）（图3）。
2.2 病原菌致病性测定
按照柯赫氏法则将SL10菌株进行致病性测定（图4），5 d后观察到不规则病斑，颜色形状与在田间自然发病得到的病斑颜色一致，再分离获得的菌株镜检后，观察到病原菌形态及分生孢子特征也一样。由此表明，该病菌确为致病菌。
2.3 病原菌分子鉴定
通过ITS1/ITS4引物进一步对该菌进行分子确认，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测获得一条大小约为0.5 kb的条带（图5），经测序最后所得534 bp全长序列。经GenBank数据库中的BLASTn序列经比对分析，结果表明，该序列与数据库中KC005678～KC005680（Leptosphaeria sacchari）来自玉米甘蔗小球腔菌ITS的复盖度为100%，其同源性高达99%。通过与GenBank数据库中登录的13条Leptosphaeria属序列构建的系统发育树揭示，SL10与Leptosphaeria sacchari的同源性最高，聚为一个分枝（图6）。最终结合形态学观察结果，将SL10鉴定为甘蔗小球腔菌Leptosphaeria sacchari。
2.4 病原菌生物学特性分析
根据病原菌生物学特性测定结果表明，甘蔗小球腔菌菌丝体生长的合适温度为13～30 ℃，最适宜温度为25 ℃，低于13 ℃或高于30 ℃时，菌丝体生长受抑制或不能生长（图7-A）；合适pH值范围为4～11，最适宜的pH值为5（图7-B）；全黑暗培养最有利于病原菌生长（图7-C）；该病菌在含麦芽糖和葡萄糖的培养基中菌落生长状况最好，菌丝致密茂盛，生长速率快，由此表明麦芽糖和葡萄糖是该菌生长的最适合碳源（图7-D）；该病原菌在含L-丝氨酸培养基上生长速度最快（图7-E），菌丝体生长浓密，为该菌生长的最适氮源。
2.5 病原菌杀菌剂敏感性测定
敏感性实验表明，各供试药剂浓度对数与生长抑制率几率值之间表现出线性相关，只是不同杀菌剂对甘蔗环斑病菌的毒理存在明显差异。在6种供试药剂中，其中咪鲜胺、丙环唑、多菌灵、腈菌唑等4種药剂对甘蔗环斑病菌菌丝体生长具有显著的抑制效果，其平均EC50值分别为0.397 6、2.251 9 L、2.163 4、4.827 3 μg/mL。比较而言，代森锰锌的抑制作用较差，其EC50值为19.919 8 μg/mL；而百菌清对环斑病菌抑制效果最差，其EC50值高达385.064 4 μg/mL（表2）。在EC95方面药剂之间差异则更加明显，其最小值与最大值范围介于5.583 4～63 268.18 μg/mL之间，两者相差达113 957倍（表2）。
3 讨论与结论
甘蔗环斑病是甘蔗叶片上一种普遍发生的真菌性病害。一直以来，该病害并未被引起足够重视。近年来，该病呈现出危害加重之势[2，4-5]。根据调查显示，在贵州甘蔗环斑病由以前的次要病害上升为主要病害了[9]。本研究针对海南昌江十月田甘蔗种植地出现一种疑似甘蔗环斑病的叶斑病，开展了病原菌的分离与鉴定，最终将疑似叶斑病其病原菌鉴定为引起环斑病的小球腔菌[Leptosphaeria sacchari V. Breda. de Haan]。本研究中无论是观察到的病症还是病原鉴定结果均与易代勇等[1]报道的甘蔗小球腔菌危害症状以及形态特征相一致。随后，进一步对其生物学特性进行了分析。实验结果表明，与山杨黑色小球腔菌相似，在温度为25 ℃左右条件下有利于病害的发生[11]。据了解，本研究系第一次较为详细报道甘蔗环斑病病原鉴定及生物特性。
有关该病的化学药剂防治研究方面，李向勇和易代勇对果蔗黔糖3号环斑病作了田间药效防控试验，筛选出防效较好的药剂为70%甲托+50%代森锰锌混合液和50%氯溴异氰尿酸600倍液[9]。为了获得更多防治该病害药剂，本研究对6种化学药剂进行了室内毒力测定。药剂筛选试验结果表明，95%咪鲜胺抑菌效果最好；其次是80%多菌灵，96.4%丙环唑次之，百菌清的抑菌效果最差。需要注意的是，此次药剂试验中，仅在室内做了毒力测定，筛选出了几种效果较好的杀菌剂，并未得到室外或大田试验的验证，所以上述几种杀菌剂对环斑病菌的抑菌作用还有待进一步的明确，以便更科学地指导大田防治。
参考文献
[1] 易代勇， 雷朝云， 李向勇， 等. 黔糖3号果蔗病害调查与病原菌鉴定初报[J]. 中国农学通报， 2006（9）： 346-350.
[2] 龙友华， 刘洋洋， 吴小毛， 等. 贵州甘蔗真菌病害初步调查及褐斑病防治药剂筛选[J]. 植物保护， 2015， 41（4）： 186-190.
[3] 杨世常.云南德宏蔗区甘蔗病虫草害的发生及防治[J]. 中国糖料， 2013， （3）： 75-80.
[4] 韦金菊， 邓展云， 黄诚华， 等. 广西甘蔗主要真菌病害调查初报[J]. 南方农业学报， 2012， 43（9）： 1 316-1 319.
[5] 熊国如， 李增平， 赵婷婷， 等. 海南蔗区甘蔗病害种类及发生情况[J]. 热带作物学报， 2010， 31（9）： 1 588-1 595.
[6] 易代勇， 李向勇， 雷朝云， 等. 黔糖3号果蔗病害的致病原因与防控对策[J]. 贵州农业科学， 2008， 36（1）： 97-99.
[7] 黄应昆， 李文凤. 云南省甘蔗常见病害及其防治[J]. 云南农业科技， 1999， （3）： 32-36.
[8] 陈庭俊.福建省甘蔗病害的发生及主要病害的防治[J].甘蔗. 1999， （4）： 18-22.
[9] 李向勇， 易代勇. 黔糖3号轮斑病防控试验初报[J]. 贵州农业科学， 2008， 36（5）： 87-88.
[10] White T J， Bruns T， Lee S， et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In： PCR Protocols： A Guide to Methods and Applications[M]. eds. Innis M A， Gelfand D H， Sninsky J J， et al. New York， Academic Press， Inc， 1990： 315-322.
[11] 柳惠慶. 一种国内未见报道的山杨黑色小球腔菌[J]. 河北林学院学报， 1986， 1（1）： 103-105.