摘要：2015年冬小麦返青期，山东单县冬小麦出现叶片变黄、植株矮小，毛细根上出现开水烫过的水渍状，造成了部分死苗现象，点片发生。为明确病原和有效防治该病害，本研究对病原菌进行分离培养、致病性测定、形态学观察及分子生物学鉴定。结果表明，山东单县冬小麦根腐病（称为腐霉根腐病）由瓜果腐霉Pythium aphanidermatum引起。
关键词：腐霉根腐病；瓜果腐霉；冬小麦
中图分类号：S435.121.4+7文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）11-0095-03
Identification of Pathogen Causing Wheat Root RotⅡ
Zhang Yueli， Qi Junshan， Zhang Bo， Ma Liguo， Xu Zuoting， Li Changsong， Qi Kai
（Institute of Plant Protection， Shandong Academy of Agricultural Sciences/
Shandong Provincial Key Laboratory of Plant Virology， Jinan 250100， China）
AbstractA disease was observed on winter wheat in Shanxian of Shandong Province at the returning green stage in 2015. The infected wheat seedlings showed yellow leaves，dwarf plants and water-soaked capillary roots， and some seedlings died. The disease occurred in spots and patches. To identify the pathogen and control the disease effectively， the pathogenic bacterium was isolated from the infected wheat roots. Based on its morphology biological characteristics， pathogenicity and molecular biology identification， the pathogen was identified as Pythium aphanidermatum.
KeywordsPythium root rot； P. aphanidermatum； Winter wheat
小麦腐霉根腐病是世界性病害，现全国均有分布。小麦受到腐霉菌侵染后，根系常表现为变褐腐烂，地上部分生长不良，产量降低，种子和幼苗在出土前就可霉烂和死亡。近年来，山东菏泽单县冬小麦返青后出现了外围叶片萎蔫的症状，呈点片发生，发病轻的植株根系水渍状，似开水烫过，发病重的植株根部变褐腐烂，地上部分生长不良，造成了死苗现象。本研究通过病原菌分离、致病性测定、形态特征及分子鉴定，明确引起冬小麦根腐病（称其为小麦腐霉根腐病）的病原，以期为该病害发生规律的探究和综合防治措施的制定提供理论依据。
1材料与方法
1.1样品采集
2014年2—3月于山东单县冬小麦田调查病害发生和危害情况，对田间病株症状进行观察记载，采集叶片萎蔫变黄甚至死亡的典型植株，备用。
1.2病原菌的分离、培养及纯化
病原菌分离采用组织分离法。将病株水渍状毛细根剪成0.5～1.0 cm小段，用自来水冲洗24 h，0.05%次氯酸钙溶液消毒10 min，放入WA平板28℃培养24～48 h，采用单孢分离法进行分离纯化，转移到CMA培养基上，将纯化好的菌株SDHZ-1保存备用。
WA培养基：琼脂粉18 g，用去离子水混合配制 1 000 mL。
CMA培养基：玉米粉60 g，60℃水浴2 h，过滤取滤液，琼脂粉18 g，用去离子水混合配制 1 000 mL。
1.3致病性测定
将SDHZ-1转移到CMA平板上28℃暗培养7 d。将沙土和塑料盆用甲醛消毒。将培养好的SDHZ-1菌株接种到灭菌玉米粒上培养7 ～10 d，制成菌剂。菌剂与灭菌沙土（菌∶沙土质量比为5∶100）混合均匀后，装入消毒的塑料盆内，取健康小麦种子（品种为济麦22）催芽后，种植在塑料盆内，每盆种植10株，10～15℃培养。对照接种灭菌玉米粒。观察并记录发病情况，待发病后，将根取出，取有水渍症状的小麦根，分离致病菌，观察与接种菌是否一致。
1.4病原菌形态观察
将SDHZ-1在CMA培养基上培养7 d后，观察菌落形态特征。将SDHZ-1在WA平板上暗培养，2 d后移取边缘菌丝至皮氏（Petris）培养液中，28℃培养2～5 d挑取孢子囊，观察孢子囊形态，测量孢子囊大小。待出现藏卵器、雄器、卵孢子后，观察藏卵器及雄器的形态和着生位置、配合情况及卵孢子的形态特征，每项指标分别观察测量50个，计算平均值。
1.5病原菌分子生物学鉴定
1.5.1病原菌DNA的提取将供试菌株接种到CMA培养基上，25℃培养5 d，收集菌丝。基因组DNA的提取和纯化采用CTAB法，并置于-20℃冰箱中备用。
1.5.2COⅠ基因扩增PCR反应在ABI 2720 PCR仪上进行。使用50 μL PCR反应体系：缓冲液（20 mmol KCl， 10 mmol （NH4）2SO4，2 mmol MgCl2，20 mmol Tris-HCl， pH 8.4）、dNTP各200 μmol，腐霉菌特異性引物FM52R （5′-TTAGAATGGAATTAGCACAAC-3′， FM55 （5′-GGCATACCAGCTAAACCTAA-3′）各15 pmol，Taq DNA聚合酶2.5 units、模板DNA 100 ng。PCR反应条件：95℃预变性3 min；94℃变性40 s，54℃退火50 s，72℃延伸70 s，共35个循环；72℃延伸10 min。经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。在每次反应中设阴性对照（不含模板DNA）。
1.5.3PCR扩增产物测序和序列分析PCR扩增产物经DNA试剂盒纯化回收后，送上海生工进行测序。将测序结果在GenBank上与已发表的基因进行同源性比对。
2结果与分析
2.1小麦腐霉根腐病症状及致病性测定
小麦腐霉根腐病最初在田间呈点状发生，植株矮小，病株周圍的小麦也逐渐受到侵染发病。SDHZ-1能侵染冬小麦种子，引起种子腐烂，降低出苗率；苗期冬小麦受到到侵染后，根系短小，次生根减少（图1B），地上部分矮化，鲜重减轻，第一片叶卷曲，叶片不能正常伸展（图1A）。
A：人工接菌SDHZ-1地上部症状；B：人工接菌SDHZ-1根部症状
图1人工接菌症状
2.2形态特征观察
SDHZ-1菌株的孢子囊由姜瓣状或不规则菌丝构成，常为膨大的菌丝状结构，顶生或间生。藏卵器球形，直径17.5～31.3（av. 23.3）μm，光滑，多顶生，偶尔间生或直接从菌丝上长出，柄较直。雄器细胞屋顶状、袋状、宽棍棒状、瓢状或玉米粒状，每个藏卵器有1～2个雄器，雄器多数以顶端、偶尔以侧面与藏卵器接触。卵孢子球形，直径15～28.8（av. 20.6）μm，不满器，偶尔几乎满器，单生。该菌株的形态特征与余永年描述的P. aphanidermatum基本一致[1]。
2.3序列分析
经FM52R和FM55引物对扩增COⅠ序列，从SDHZ-1菌株基因组中扩增获得1 106 bp的序列，在Genebank中进行序列一致性比较。结果表明，SDHZ-1的COⅠ序列与P. aphanidermatum （Genebank号：HQ708485）的同源性为100%。
利用 Mega5.2.2 软件对不同菌株COⅠ 序列进行进聚类分析，结果表明供试菌株SDHZ-1与P. aphanidermatum （ GenBank 号：HQ708485）为同一分支，进化距离最近（图 2）。根据病原菌的形态特征及COⅠ序列同源性比较结果，鉴定SDHZ-1为瓜果腐霉P. aphanidermatum。
3讨论与结论
Vanterpool最早于19世纪30年代在加拿大发现Pythium arrhenomanes 等常可导致谷物根腐病。我国已报到的小麦根腐病病菌有麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana、尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum、层出镰孢菌Fusarium proliferatum、黄色镰孢菌Fusarium culmorum等[2]，由腐霉菌引起的小麦根腐病国内研究的较少。而余永年等[3]对我国不同植被土壤中腐霉菌种类及其数量分布做了大量研究后发现，大田土（包括麦类土等）中腐霉数量仅次于菜田土，并从中分离到了15种腐霉菌；在禾谷类区系中，以瓜果腐霉P. aphanidematum、强雄腐霉P. arrehenomanes、禾生腐霉P. graminicola和终极腐霉P. ultimum较为丰富。1989—1990年，王政逸等[4]从浙江省各冬小麦产区的病株和麦田土壤中分离鉴定了5个腐霉种，并对其做了致病性研究。经分离和致病性检测，浙江省引起大、小麦根腐病的腐霉菌包括P. dissotocum、P. irregulare、P. polypapillatum、P. spinosum和P. ultimum 5种[5]，均能引起供试大、小麦的根腐、根褐变和坏死，第一片叶卷曲，抑制植株生长，造成植株各部不同程度的矮化和变短，与本研究中分离的病原菌——瓜果腐霉P. aphanidematum致病性测定时症状相似。
由瓜果腐霉菌P. aphanidematum引起的病害国内研究的较多。徐作珽等[6]研究发现瓜果腐霉P. aphanidematum可引起玉米典型的青枯症状，并认为山东玉米茎基腐病的病原菌以瓜果腐霉P. aphanidematum为主，与禾谷镰刀菌F. graminearum复合侵染时引发的病害更为严重。本研究从山东单县冬小麦区感病小麦植株根部分离的病原菌，经形态和分子鉴定为瓜果腐霉P. aphanidematum，有关该病害的发生流行规律、侵染循环及防治措施等还需进一步研究。
参考文献：
[1]余永年. 中国真菌志（第六卷.霜霉目）[M]. 北京： 科学出版社， 1998.
[2]张德珍， 李鹏昌， 陈晓霞，等. 山东省小麦根腐病病原菌的分离鉴定 [J].植物保护学报， 2016， 43（2）： 233-240.
[3]余永年， 马国忠， 刘晓娟. 腐霉属分类性状评价及中国的种[J]. 真菌学报， 1990， 9（4）： 249-262.
[4]王政逸， 张炳欣， 楼兵干. 浙江省小麦根围土壤（Pythium spp.）的一些生态学研究[J]. 植物病理学报， 1996， 26（1）： 29-35.
[5]沈杰， 张炳欣. 浙江省大、小麦直径腐霉的研究[J]. 植物病理学报， 1994， 24（2）： 107-112.
[6]徐作珽， 张传模. 山东玉米茎基腐病病原菌的初步鉴定[J].植物病理学报， 1985，15（2）： 103-108.山 东 农 业 科 学2017，49（11）：98～104Shandong Agricultural Sciences山 东 农 业 科 学第49卷第11期徐伟丽，等：3种三萜类化合物对黄胸散白蚁生物活性及纤维素酶的影响DOI：10.14083/j.issn.1001-4942.2017.11.019