摘要：采用对峙培养法，从97株枇杷内生真菌中筛选出对枇杷根腐病病菌有拮抗活性的菌株。结果表明，97株真菌对枇杷根腐病病菌均有一定的抑制效果，抑制率≥60%的菌株有25株，在50%～59%之间的菌株共30株，在50%以下的菌株42株。抑制率在50%以上的菌株共55株，占总数的56.7%，其中P3.9、YPG4、PGSC3′、YPLY1、YPLY2、YPG1、DPG3、DPG4和DPG6等 9株菌株的抑制率均在70%及以上，P3.9和YPG4 等2株菌株抑菌率分别达到88%、82%。
关键词：枇杷；根腐病；内生真菌；抑菌活性
中图分类号：S436.67+9文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）01-0095-03
收稿日期：2013-04-26
基金项目：云南省大学生创新试验计划；红河学院博硕项目（编号：XJ1B0912）；云南省高校“农作物优质高效栽培与安全控制重点实验室”建设经费；红河学院硕士点植物保护一级学科建设项目。
作者简介：鲁海菊（1978—），女，云南大理人，博士研究生，副教授，主要从事亚热带植物真菌分类和真菌病害研究。E-mail：luhaiju2011@126.com。枇杷[Eriobotrya japonica （Thunb.） L.]为蔷薇科乔木，是南方主要果树之一。随着栽种面积不断扩大，枇杷受到各种真菌病害不同程度的危害，严重影响了枇杷的品质和产量。在《中国真菌总汇》中记载了我国枇杷圆斑病（Phyllosticta eriobotryae）、灰斑病（Pestalotia eribotryae）、炭疽病（Glomerella cingulata）等18种真菌性病害[1]，中国台湾发现枇杷角斑病（Cercospora eribotryae）等9种真菌性病害[2]，福建省报道枇杷污叶病（Clasterosporium eriobotryae）等13种真菌性病害[2-3]，截至2005年，我国共报道42种枇杷真菌性病害[4]。据笔者调查可知，云南蒙自有5种枇杷真菌性病害，分别为圆斑病、灰斑病、角斑病、炭疽病和根腐病。其中根腐病尤其严重，它是由枇杷叶拟盘多毛孢（Pestalotiopsis eriobotrifolia）引起的一种土传真菌病害。自2005年以来，蒙自枇杷根腐病在各产区严重发生，发病率超过40%，严重制约着当地枇杷产业的发展。枇杷根腐病病原菌的种类各地区报道不一致，中国台湾报道的根腐病是由寄生疫霉（Phytophthora parasitica）引起的[5]，福建莆田报道的由帚梗柱孢属（Cylindrocladium sp.）引起[6]。而笔者所在的研究组将云南蒙自枇杷根腐病病原菌初步鉴定为枇杷叶拟盘多毛孢（P. eriobotrifolia）。据文献报道，枇杷叶拟盘多毛孢也是枇杷叶部灰斑病[2]和枇杷花腐病[7]的病原菌。枇杷根腐病无论是由哪种真菌引起的，其共同点都是土传真菌病害。化学防治对于土传病害收效甚微，加上化学农药不符合绿色农业生产要求，生物防治日趋受到人们的重视。内生真菌是一类在健康植物组织内定殖但不会引起病害症状的真菌[8]，具有广阔的开发应用前景。李雅等以苹果腐烂病菌（Cytospora sp.）、番茄灰霉病菌（Botrytis cintrea）、西瓜枯萎病菌（ Fusarium oxysporium f. sp. niveum ）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium f. sp. cucumerinum）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）和白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae）为供试菌种，对杜仲（Eucom miaulmoides）的49株内生真菌及其次生代谢物进行抑菌活性测定，结果表明，有9株内生真菌对6种测试菌都有抑制作用，4株内生菌的次生代谢产物对6种测试菌都有抑制作用[9]。对除虫菊[10]、冬青卫矛[11]、连翘[12]、海金沙[13]、喜树[14]和杜仲[15]内生真菌也开展过类似的生物防治研究。因此，本试验试图从枇杷根、茎、叶和果实中分离到的97株内生真菌中筛选出对枇杷根腐病病菌有拮抗活性的菌株，为枇杷根腐病土传真菌病害的有效、可持续防控提供生防菌种资源。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1枇杷内生真菌及枇杷根腐病病原菌笔者所在的实验室从蒙自枇杷园区采集枇杷根、主干、枝条、老叶、新叶、果实及根腐病病样，常规组织分离[16]获得供试菌株。
1.1.2供试培养基供试培养基为PDA：马铃薯200 g、葡萄糖16 g、琼胶 20 g、蒸馏水1 000 mL。
1.2方法
1.2.1对峙培养将已分离纯化病原菌和内生真菌菌株在PDA平板培养基中，28 ℃恒温扩大培养7 d，采用对峙培养法[17]在培养基同一半径周围用打孔器取直径为5 mm的菌丝块，分别接种于无菌PDA平板（直径90 mm）中，2个接种点相距40 mm，以不接种供试菌株作为对照，设3次重复，在 28 ℃ 下恒温培养，7 d后测定病原菌的菌落直径，计算其生长抑制率：抑制率=（dCK-dB）/dCK×100%，其中dCK表示对照病原菌菌落直径，dB表示处理病原菌菌落直径。
1.2.2数据统计所有试验数据均采用 SPSS 19.0统计软件进行统计，经 Duncans多重比较各处理间的差异显著性。
2结果与分析
2.1抑制率≥60%的菌株的抑制效果
2.2抑制率在50%～59%之间的菌株的抑制效果
表2显示，30株菌株与病原菌对峙培养7 d后，病原菌菌落生长直径与对照直径差异极显著（P<0.01），表明这30株菌株对病原菌有很强的抑制效果，且其抑制率在50%～59%之间。
2.3抑制率在50%以下的菌株数量及其抑制效果
表3显示，42株菌株与病原菌对峙培养7 d后，病原菌菌落生长直径与对照差异极显著，表明这42株菌株对病原菌有抑制效果。
3结论与讨论
本研究结果表明，分离自枇杷根、茎、叶和果中的内生真菌对其根腐病病菌都表现出一定的抑制效果，其中抑制率在70%以上的9株菌株中来自根部的5株，占55.6%；来自叶片的2株，占22.2%；来自主干和果实的各1株，各占 11.1%。说明枇杷各个器官都存在抑制根腐病病菌的内生真菌（花中有待研究），但其根部存在的菌株占大多数。
枇杷根腐病症状表现为：初期树势衰退，叶片起初变黄，变成褐色之后脱落；茎基部腐烂，茎干呈暗褐色，根部环腐，不长新根。虽然根部存在大量抑制其根腐病病菌的内生真菌，
表2抑制率在50%～59%之间的菌株抑制效果但是根还是遭到病原菌的侵染危害。本试验的供试内生真菌中除了P3.9是在分离枇杷根腐病病原菌的过程中无意间从病样中分离获得之外，其余菌株都是从健康枇杷植株中分离获得的。病株根部是否存在抑制其根腐病病菌的菌株呢？如何做到健康植株根部存在的拮抗菌大量定殖，让其免遭病原菌的侵染危害？这些问题都是今后需要进一步研究的课题。P3.9菌株经形态学鉴定为木霉属（Trichoderma）的真菌，对枇杷根腐病病菌的抑制率达到88%。木霉菌是全球普遍应用的生防真菌，主要用于防治各类植物的土传病害[18]，至少对18属20 余种病原菌有拮抗作用[19]。另外，武汉琴等曾报道茶树内生木霉在其体内成功定殖[20]。本试验中，P3.9木霉菌株分离自枇杷主干韧皮部，应属于内生真菌，如果它能在枇杷各个器官中大量定殖，就可以发挥内生菌作为生防菌独有的优势：其一，专一性很强，除了对其宿主植物及取食或感染宿主植物的生物起作用外，对其他生物没有直接影响；其二，可人工接种导入不同的植物并通过宿主的种子进行遗传[21]；其三，在植物组织内有足够的碳源、氮源，还受植物组织的良好保护，具有更稳定的生存环境，更易于发挥生防作用[22]。因此，P3.9具有广阔的应用前景，为枇杷根腐病的生物防治提供了菌种资源。
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