摘要巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium）B196菌株产生的拮抗物质对水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）的生长具有较强的抑制作用，明确该菌产生拮抗物质的种类是进一步研究该菌的抑菌机制及其应用的基础。本文采用盐酸沉淀B196菌株的去菌体培养液，再用甲醇抽提获得拮抗物质的粗提物。利用反相HPLC系统，将粗提物过C18柱，收集有抑制水稻纹枯病菌生长作用的活性化合物。运用质谱测得其分子量分别为1 042.592 7 u，再利用碰撞诱导解离(CID)技术获得化合物的典型结构特征离子碎片，结果表明其一级结构为ProAsnSerβAAAsnTyrAsnGln (βAA为14个碳原子的氨基脂肪酸)。綜合以上信息将该化合物鉴定为Iturin A2。
关键词巨大芽胞杆菌；iturin A2；分离纯化
中图分类号:S482.292文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.05291542.2014.02.004Isolation and purification of an antimicrobial substance produced
by Bacillus megaterium strain B196 Liao Ting,Qin Jian,Yuan Gaoqing,Li Qiqin,Lin Wei,Peng Haowen(College of Agriculture,Guangxi University, Nanning530005, China)AbstractAn antimicrobial substance produced by Bacillus megaterium strain B196 can strongly inhibit the growth of Rhizoctonia solani．Identification of the antimicrobial substance is very important for further research on the inhibition mechanism and its application．Crude antimicrobial substances were extracted with methanol from the precipitate which was obtained by adding HCl to the cellfree culture broth and then stored at 4 ℃ overnight．The crude extract was further purified by reversedphase HPLC with a C18 column（PRCODS，20×250 nm）to separate the substances．An antifungal compound with strong inhibitory activity against R.solani was purified．The molecular weight of the compound was 1 042.592 7 u by Matrixassisted laser desorption ionization timeofflight mass spectrometer(MALDITOFMS)．TESI collision induced dissociation mass spectrometry analysis demonstrated that the compound had a primary structure of ProAsnSerβAAAsnTyrAsnGln. Therefore, the compound was identified as Iturin A2.
Key words Bacillus megaterium；iturin A2 ；isolation and purification 巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium de Bary）是一类好氧、革兰氏阳性、可生长在土壤和植物体内的芽胞杆菌细菌，它可以被用来吸附金属Au3+［1］、净化水体［2］、降解农药［3］、解磷解钾［4］等，被广泛地应用在环境保护方面。此外，巨大芽胞杆菌还可以产生抑制植物病原菌的抗菌物质［5］，因而在植物病害防治方面也受到人们的关注。目前已有报道分离出一些对植物病原菌有较强拮抗作用的菌株［6］，一些菌株对一些植物病害有较好的防治作用［7］，巨大芽胞杆菌可产生的抑菌物质有蛋白类［5］、挥发性物质［8］、细菌素［9］和脂肽类物质等［10］。
巨大芽胞杆菌B196菌株是广西大学农学院植物病理研究室从水稻上分离出来的拮抗细菌，在离体、盆栽和大田试验中，该菌株对水稻纹枯病均表现出较好的防效［11］。前期工作发现，该菌株的发酵滤液对玉米小斑病菌［Bipolaris maydis （Nisik & Miyake）Shoem.］ 和水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani Kühn）具有较强的抑菌活性［12］。为了明确该菌株的发酵滤液所含的拮抗物质种类，本研究采用盐酸沉淀、甲醇提取和高效液相色谱分离等方法对抑菌物质进行分离纯化和鉴定，为进一步研究该菌的抑菌机制和开发防治水稻纹枯病的新型药剂打下基础。
40卷第2期廖庭等：巨大芽胞杆菌B196菌株抑菌物质的分离纯化20141材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株
拮抗菌：巨大芽胞杆菌（B.megaterium）B196菌株；植物病原菌：稻瘟病菌［Magnaporthe grisea (Hebert) Barr.］、烟草赤星病菌［Alternaria alternata（Fries） Keissler ］、烟草灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers.）、水稻纹枯病菌（R.solani）、玉米白绢病菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)、西瓜枯萎病菌［Fusarium oxysporum f.sp. niveum (E.F.Smith) Snyder et Hansen］和黄瓜绵腐病菌［Pythium aphanidermatum (Edson) Fitzpatrick］，以上病原菌均来源于广西大学农学院植病研究室。
1.1.2色谱分离材料
分析柱C18（Jupiter，5 μm，250 mm×4.6 mm）、制备柱C18（PRCODS，20 mm×250 mm）、离心浓缩机（Labconco CentriVap）、高效液相色谱仪（Shimadzu LC6AD）为岛津公司生产，乙腈、乙酸铵均为色谱级。
1.2拮抗物质的分离纯化
1.2.1B196菌株的培养及其抑菌物质的提取
以水稻纹枯病菌为靶标，采用活性跟踪分离纯化B196菌株产生的拮抗物质［13］。将保存在4 ℃的B196菌株接种于NA培养基上，在30 ℃培养48 h后取一环B196菌株接种至种子培养基（葡萄糖10 g、大豆蛋白胨10 g、牛肉浸膏3 g、蒸馏水1 000 mL、pH70）中，30 ℃、130 r/min下培养12 h后再转移至发酵培养基（蔗糖10 g、大豆蛋白胨20 g、NaCl 7 g、K2HPO4 5 g、蒸馏水1 000 mL、pH 7.0），27 ℃，130 r/min，振荡培养5 d。之后将B196菌株的发酵液6 000 r/min离心20 min，去除菌体，收集上清液，用6 mol/L的HCl将上清液的pH调为20，4 ℃下静置24 h后，于8 000 r/min离心25 min，去除上清液，收集沉淀。合并所有的盐酸沉淀，加入适量的甲醇，将pH调为7.0，静置2 h，抽提甲醇，于60 ℃下进行减压浓缩，获得深黄色的粗提物，备用。
1.2.2抗菌物质的抑菌活性测定方法
采用菌丝生长速率法：将分离纯化获得的各馏分于1/15 mol/L磷酸缓冲液（pH6.81）中溶解，取0.1 mL各馏分与5 mL的PSA培养基（45 ℃左右）混匀，倒入6 cm的培养皿中，冷却后备用。用直径为7 mm的打孔器在水稻纹枯病菌菌落边缘切取菌饼，将病菌反向接入培养皿中央，在28 ℃下恒温培养24 h后测量菌落直径，并计算抑菌率，以磷酸缓冲液和清水处理为对照，每处理3次重复。
抑菌率(%)=对照菌落直径-处理菌落直径对照菌落直径-7 mm× 100。
1.2.3HPLC分析
用流动相溶解粗提物，采用等度洗脱，液相色谱条件：色谱柱C18（Jupiter， 5 μm，250 mm×4.6 mm），流动相含乙腈10 mmol/L，V（乙酸铵）∶V（水溶液)=40∶60，波长为214 nm，流速为0.8 mL/min，室温，样品浓度为10 mg/mL，进样量为10 μL。收集各色谱峰样品，用离心浓缩机浓缩和干燥，以水稻纹枯病菌为靶标菌，采用菌丝生长速率法检测各色谱峰样品的抑菌活性。
1.2.4HPLC分离纯化
分离纯化条件：流动相含乙腈10 mmol，V（乙酸铵)∶V（水溶液)=40∶60，波长214 nm，流速为8 mL/min，制备柱C18（PRCODS，20 mm×250 mm），样品用流动相液溶解，浓度为20 mg/mL，进样量1 mL，集中收集活性峰，用离心机浓缩和冷冻干燥后获得活性物质。
1.3活性组分的鉴定
样品送至广西大学生命科学与技术学院，采用反射模式采集每个样品的一级质谱信息（MS），激光强度4 000，质量范围800~4 000 u，一级质谱扫描完成后，选取7个信号强度最高的母离子进行二级质谱分析（MS/MS），加速电压2 kV，采用CID碰撞裂解母离子，获取每个母离子的离子碎片指纹谱。
1.4纯化合物对植物病原菌的毒力测定
采用菌丝生长速率法测定化合物对植物病原真菌的毒力：用1/15 mol/L磷酸缓冲液（PBS）溶解纯品后分别配制成5种浓度，取0.1 mL纯品溶液与5 mL的PSA培养基混匀，倒入6 cm的培养皿中，冷却后接入植物病原菌，以磷酸缓冲液和清水为对照，在28 ℃下恒温培养。待对照菌落基本长满培养皿后测量菌落直径，并计算抑菌率，每处理3次重复。
2结果与分析
2.1HPLC分析
粗提物经分析柱C18（Jupiter，5 μm，250 mm×4.6 mm）分离的色谱图见图1。在8.4 min时出现一个呈正态分布的峰形，从该峰收集的样品对水稻纹枯病菌有抑菌活性。
2.2HPLC分离纯化
样本经HPLC分离纯化后，分别在3.9~6.2 min和16.4~17.2 min集中出现洗脱峰（图2），抑菌活性检测结果表明，在16.4~17.2 min出现的洗脱峰物质，在浓度为100 μg/mL时，对水稻纹枯病菌的抑菌率为81.03%，分离纯化的物质经离心机浓缩和冷冻干燥后得到的白色粉末即为纯品，且纯拮抗物质的提取率为5%。图1B196菌株产生的活性物质在分析柱中的色谱图
Fig.1HPLC chromatograms of the active substances produced by Bacillus megatherium strain B196
圖2 B196菌株产生的抑菌物质在HPLC上的分离纯化
Fig.2Purification of the active substance produced by the strain B196 on HPLC
2.3活性物质的纯度
已分离纯化的物质在分析色谱柱C18（Jupiter，5 μm，250 mm×4.6 mm），流动相含乙腈10 mmol/L，V(乙酸铵)∶V(水溶液)=40∶60，波长为214 nm，流速为0.8 mL/min 时检测其纯度，结果见图3。在8.4 min时出现一个呈正态分布的峰形，从该峰收集的样品对水稻纹枯病菌有抑菌活性。该洗脱峰与2.1 HPLC分析中在8.4 min时出现的呈正态分布峰形一致。根据面积归一法获知其面积大于94%，说明分离获得的拮抗物质纯度已达94%以上，可以进行质谱鉴定。
图3分离纯化的拮抗物质色谱图
Fig.3HPLC chromatograms of the active substance purified from the strain B1962.4活性组分的鉴定
利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）对化合物进行一级质谱分析（图4），获知该化合物的质荷比（m/z）为1 043.592 7、1 065.579 1和1 081.554 1，它们分别是化合物的质子化（M+H+）峰、钠离子（M+Na+）和钾离子（M+K+）加合峰，结果表明该化合物的分子量为1 042.592 7 u。将此质谱图结果与前人研究结果［1416］进行比对时，可以初步估计分子量为1 042.592 7 u的化合物是伊枯草菌素A2。
图4纯品的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱图
Fig.4MALDITOFMS spectrum of the purified substance图5纯品的MALDITOFMS/MS CID色谱图
Fig.5MALDITOFMS/MS CID spectrum of the purified substance
多肽类物质被电离后，会形成多种强度不同的离子，据Roepstorff P等［17］和Biemann K等［18］的报道：当电荷保留在N端时，会从多肽类物质N端3个裂解点开始分别形成an、bn、cn系列离子，且bn系列离子的质量数，是断裂后的基团的质量数；当电荷保留在N端时，会从多肽类物质N端3个裂解点开始依次形成zn、yn和xn系列离子，且yn系列离子的质量数，是断裂后的基团的质量数加上2H。其中bn系列和yn系列离子是确定氨基酸序列的关键离子，其他离子属于离子片段。
纯品的二级质谱（图5），参照Yu G Y等 ［16］描绘的模式，先将伊枯草菌素A2的一级结构排列出来，然后分成a型离子、b型离子、c型离子、x型离子、y型离子和z型离子（图6）。从图5中可以获得的a型离子、b型离子、c型离子、x型离子、y型离子和z型离子数据（表1）。因为b类型是从左至右将结构残基切断，而y类型则是由右到左将结构残基切断，所以通过图5中b、y型离子之间的差值与氨基酸残基分子量的比较，可以获得片段结构分别为SerβAAAsnTyrAsnGln、ProAsnSerβAAAsnTyr。而SerβAAAsnTyr为这两个结构片段的共同部分，所以结合这两个片段结构推断出纯品的一级结构为ProAsnSerβAAAsnTyrAsnGln。因为βAA的质荷比m/z=b4-b3=y5-y4=225，故可以推断此氨基脂肪酸链应该含有14个碳原子，且其质子化结构为-H2N+=CH-C12H25-CO-。
综合纯品的分子量和MALDITOFMS/MS CID色谱图等信息，确认其为伊枯草菌素家族的iturin A2。
图6Iturin A2质子化（M+H+）的诱导碰撞解离碎片［16］
Fig.6Possible fragments of iturin A2（M+H）+by CID
表1纯品的MS/MS数据
Table 1Mass spectrometry/mass spectrometry (MS/MS) data of the purified substance序号
Sequence numbera型离子 aionb型离子 bionc型离子 cionx型离子 xiony型离子 yionz型离子 zion170.253 3—115.291 4———2184.377 3212.315 1—271.353 5243.344 2226.239 23271.353 5299.369 5316.399 9434.435 6406.430 5—4496.548 8524.614 4541.630 0—520.505 9503.543 45610.706 5638.696 0655.711 5—745.758 0728.747 06773.766 8801.773 5818.811 6—832.779 7815.851 37—915.854 7932.905 1—946.828 4929.865 3
2.5纯化合物对植物病原菌的毒力
采用菌丝生长速率法测定纯化合物对7种植物病原菌的毒力结果见表2。结果表明：纯化合物对植物病原菌普遍具有较高的抑菌作用。其中，纯品对稻瘟病菌的毒力最强，EC50达到了11.970 0 μg/mL；其次为烟草赤星病菌、烟草灰霉病菌、水稻纹枯病菌、玉米白绢病菌和西瓜枯萎病菌；对黄瓜绵腐病菌的毒力最弱，EC50为102.059 2 μg/mL。表2纯化物质对植物病原菌的毒力1)
Table 2Toxicity of the purified substance against plant pathogenic fungi植物病原菌
Plant pathogenic fungi毒力回归方程（Y=）
Regression equation of toxicity 抑菌中浓度(EC50)/μg·mL-1
Median effective concentration95%置信区间/μg·mL-1
95% Confidence interval相关系数
Correlation coefficient稻瘟病菌
Magnaporthe grisea2.698 0X+2.091 411.970 08.345 9~17.167 80.953 3烟草赤星病菌
Alternaria alternata1.329 5X+1.329 512.381 69.210 0~16.645 50.967 4烟草灰霉病菌
Botrytis cinerea1.511 1X+2.970 222.048 015.895 2~30.582 60.962 6水稻纹枯病菌
Rhizoctonia solani2.891 0X+0.382 339.562 132.682 6~47.889 70.986 3玉米白绢病菌
Sclerotium rolfsii1.937 1X+1.872 041.186 928.719 0~59.067 40.955 4西瓜枯萎病菌
Fusarium oxysporum1.960 5X+1.537 558.359 242.626 8~79.916 60.973 6黄瓜绵腐病菌
Pythium aphanidermatum1.971 1X+1.040 4102.059 269.082 7~150.776 90.976 7
1) 数据为3次重复的平均值；EC50为根据毒力方程的计算值。
The data were the mean of 3 replicates. EC50 was the value calculating from the virulence equation.
3结论与讨论
对于脂肽化合物的分离纯化，一般都要经过盐酸沉淀、甲醇提取、硅胶柱层析、凝胶柱层析和高效液相色谱等方法才能获得纯品［13,16,19］，而本研究直接采用高效液相色谱对拮抗菌代谢产物的甲醇提取物进行分离纯化，并獲得纯度较高的iturin A2，简化了步骤。陈华等［20］也是通过高效液相色谱获得了iturin A2，但是他们采用梯度洗脱，流动相采用0.1%三氟乙酸的乙腈：0.1%三氟乙酸的超纯水，25 min内由30∶70逐渐过渡为55∶45，且在18.5 min左右才能开始收集iturin A2。而本研究是通过等度洗脱，在图1中，iturin A2在8.4 min即可收集，说明此条件可以更加快速、高效地获得纯品。
飞行时间质谱技术是近年发展较快的一门技术，它在生命科学研究领域得到了广泛的应用，尤其是在蛋白质的鉴定方面，不少研究者［2022］通过飞行时间质谱技术对肽类物质进行鉴定，并获知了该物质的结构。本研究亦利用此技术将巨大芽胞杆菌B196菌株分泌的拮抗物质进行鉴定，并确定其一级结构为ProAsnSerβAAAsnTyrAsnGln。
Iturin A普遍存在于枯草芽胞杆菌［2223］和解淀粉芽胞杆菌［15,24］的代谢产物中，目前iturin A已被鉴定出有7个同系物，即iturin A2~A［15］8，它们之间的区别在于分子量、一级结构和β氨基脂肪酸链。本研究中，纯品经过MALDITOFMS和MALDITOFMS/MS鉴定后，发现它的分子量和一级结构与iturin A2相同，所以将其鉴定为iturin A2。Pueyo M T等［10］对巨大芽胞杆菌的脂肽物质进行分离纯化，从中获得了质荷比（m/z）为1 041、1 065的表面活性素、1 057的伊枯草菌素和1 464的丰原素，但由于iturin A3、iturin A4和iturin A 5的质荷比（m/z）均为1 057，因此还需要进行核磁共振技术才能确定其β氨基脂肪酸链的结构。在本研究中，首次发现巨大芽胞杆菌存在着iturin A2。
Iturin A2能够抑制立枯丝核菌（R.solani）［16］、玉米小斑病菌（B.maydis）［13］和小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）［19］等植物病原真菌的生长，也能够抑制水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae )和黄瓜细菌性角斑病菌（Pseudomonas syringae pv. lachrymans）［25］等植物病原细菌的生长。同时，iturin A2在田间可有效地防治玉米小斑病［13］。在本研究中，iturin A2虽然对卵菌的抑制作用相对较差，但是对植物病原菌普遍都具有较高活性，这一点跟陈华等［19］的研究结果相似。可见，巨大芽胞杆菌（B.megaterium）B196菌株分泌的iturin A2对植物病害具有较好的生防潜力，具有开发成防治植物病害生物型农药的前景。
据报道，巨大芽胞杆菌作为生防菌，可防治南方根结线虫［Meloidogyne incognita (Kofoid and White) Chitwood］［26］、小麦全蚀病［Gaeumannomyces graminis var．tritici (Sacc.) Walker］、小麦纹枯病(Rhizoctonia cerealis van der Hoeven)、棉花立枯病（Rhizoctonia solani Kühn）和棉花枯萎病［Fusarium oxysporum f．sp．vasinfectum (Atk.)Snyder et Hansen］［27］等植物病害，但普遍存在着对植物病害防治效果低、防效单一、防效易受菌体在土壤中定殖能力的影响等缺点［27］。本研究已确定巨大芽胞杆菌（B.megaterium）B196菌株分泌出的抗菌物质是iturin A2，但在田间对植物病害的防效如何，有待试验证实。
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