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摘 要：莲腐败病是白莲种植区发生最普遍、为害最严重的病害之一。本试验对发病白莲上的病原菌进行分离鉴定。该病原分离物在PSA培养基上气生菌丝由白色渐变成深紫色，并产生大小两种孢子。大型分生孢子镰刀形，无色，稍呈弯曲，两端尖细，大小为（39.1～55.2）μm×（2.8～4.6）μm，多为3个隔膜，少部分为1～2隔或4～5隔；小型分生孢子椭圆形，无色，无隔膜，大小为（5.0～9.2）μm×（2.0～3.5）μm。致病性测定表明分离物能100%引起白莲出现典型的白莲腐败病的症状。ITS1/ITS4的PCR扩增产物与GenBank中Fusarium oxysporum f. sp. nelumbicola的序列同源性为99%。研究结果表明，分离到的病原物为尖孢镰刀菌莲专化型F. oxysporum f. sp. nelumbicola。
关键词：莲腐败病；尖孢镰刀菌莲专化型；鉴定
中图分类号：S436.45 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2013）18-0092-03
白莲（Nelumbo nucifera Gaertn）是一种水生经济作物，在我国分布很广，南北都有种植。改革开放后，特别是近些年来，我国子莲产业发展迅速。据统计，全国子莲种植面积10万hm2以上，是我国种植面积最大的水生作物之一。莲腐败病是莲种植区发生最普遍、为害严重的病害之一，在生长期和莲藕贮藏期均可发病，分布广阔，全国各莲区均有发生[1]。莲腐败病属土传病害，病菌往往造成藕鞭、藕节、藕根腐烂，同时地上部分的叶、花也会萎蔫黄枯，发病严重的整株枯死[2]。
江西白莲主产区每年有30%～70%的莲发生莲腐败病，10%～15%的严重发生莲腐败病，颗粒无收，莲农损失惨重。目前对该病害的致病机理、病害发生流行规律及有效的防治措施等鲜有报道，为病害的防治带来了较大的困难。莲腐败病已成为阻碍白莲产业持续发展的一大障碍。本试验以广昌发病白莲为材料结合传统的植物病原鉴定方法和分子生物学技术对该病害的病原菌进行了鉴定。
1 材料与方法
1.1 病菌的分离鉴定
2011年7月从江西省广昌县采集具有典型白莲腐败病症状的病株，参照刘国安[2]的方法取病株莲鞭、节和须根进行病菌分离，在马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）平板上28℃明暗12 h交替培养；待菌落生长后取先端菌丝进一步纯化。观察菌落形态、分生孢子产生及其形态和大小。
1.2 致病性测定
将纯化的病菌于PSB液体培养基中培养制成10-6的孢子菌悬液针刺接种到莲籽育出2 a生健康的莲藕和莲鞭上，莲藕保湿24 h后栽回灭菌土中，莲鞭于28℃光照培养箱中保湿；以无菌水为对照接
种[2，3]。
1.3 DNA的提取
将分离的经致病性测定的病原菌采用PSA液体培养基在28℃ 120 r/min培养48 h后过滤收集菌丝，将菌丝转移至灭菌的研钵中，用液氮将菌丝迅速研磨成粉末。采用CTAB法提取总DNA[4]。
1.4 ITS区段扩增分析
利用ITS通用引物ITS 1（5"-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3"）/ITS 4（5"-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3"），以总DNA 为模板，进行扩增[4]。PCR反应体系为：10×PCR Buffer 2.5 ？滋L，10 mmol/L each dNTP 0.5 ？滋L，ITS1（10 pmol） 0.5 ？滋L，ITS4（10 pmol）
0.5 ？滋L，ddH2O补足25 ？滋L。反应程序为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，54℃ 35 s，72℃
1 min，30 个循环；72℃ 5 min；16℃保存。
取PCR产物各8 ？滋L，0.6%琼脂糖凝胶加5% Goldview染液，TAE缓冲液，100 V稳压电泳50 min，用凝胶成像系统分析结果[5]。根据DL2000 Marker标准核酸中对应条带位置推断提取出的DNA分子量大小范围。将回收的PCR产物连接至pMD18-T载体上，转化大肠杆菌JM109感受态，利用菌落PCR筛选阳性克隆，送至上海英潍捷基贸易有限公司测序。
1.5 同源性比对及系统发育分析
测序结果与GenBank 数据库中的已知序列进行BLAST比对，确定与试验菌株亲缘关系最近的种属。从GenBank数据库获得相关种属的ITS区序列，利用MEGA 4.0软件[6]构建系统发育进化树，确定分离菌株的分类地位。序列对排用CLUSTAL X1.83 program[7]，进化树的构建用Neighbour-joining方法。进化树分支模式的稳定性用SEQBOOT和CONSENSE program进行bootstrap分析，重复次数为1 000，计算各分支的置信度[8]。
2 结果与分析
2.1 病原菌的形态鉴定
对引起广昌白莲腐败病的病原物进行分离，并进行形态鉴定。病原物在PSA培养基上气生菌丝早期为白色随后变成深紫色，经明暗交替培养20 d后产生大小两种孢子。大型分生孢子镰刀形，无色，稍弯曲，两端尖细，大小为（39.1～55.2）μm×（2.8～4.6）μm，多为3个隔膜，少部分为1～2隔或4～5隔；小型分生孢子椭圆形，无色，无隔膜，大小为（5.0～9.2）μm×（2.0～3.5）μm；厚垣孢子球形，顶生或间生，单胞，直径4.5～11.5 μm。初步鉴定为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）。
2.2 致病性测定结果
莲鞭接种4 d后针眼处便有菌丝生长，10 d后将莲鞭沿针眼处纵截面切开，可见接种点变褐腐烂（图1A）；对照不发病。莲藕接种后自然条件下60 d后可见典型病状（图1B）。
2.3 ITS区PCR扩增
采用通用引物ITS 1和ITS 4对其中致病性较强的6个菌株（F11-1、F11-2、F22-1、F32A、F23C和F23D）的ITS区rDNA进行PCR扩增，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并与标准分子量比较，结果显示，均出现一条长度约为500 bp的扩增条带（图2），条带特异性好。
2.4 ITS区域同源性比对
采用通用引物对6个菌株的ITS区rDNA进行PCR扩增后，对扩增产物进行克隆测序获得500 bp的扩增产物。将获得的序列与GenBank数据库中已报道的序列进行Blast分析，6个菌株与已知尖孢镰刀菌莲专化型（台湾）Fusarium oxysporum f. sp. nelumbicola，F. oxysporum f. sp. rapae和 F. oxysporum f. sp. raphani的同源性最高为98.7%～99.3%。6 个菌株之间ITS序列同源性为99%以上。
2.5 系统发育学分析
将6个菌株的ITS区序列与同源性较高的相关种的ITS区构建系统发育树（图3），结果表明，从莲上分离的6个菌株与尖孢镰刀菌莲专化型（DQ002550）及尖孢镰刀菌其他专化型聚在一起构成一个分支，支持度为95%，进一步证明广昌白莲腐败病病原菌为尖镰孢菌莲专化型。
3 结论与讨论
尖孢镰刀菌形态鉴定的重要特征是大孢子的形状、大小以及隔膜的个数，而大孢子的产生需要一定的培养时间和相应的诱导条件，这为形态鉴定带来了一定的困难。我们也一直在摸索便利的分子检测鉴定的方法，rDNA ITS区受到的选择压力较小，进化速率较快。在绝大多数真核生物中表现出极为广泛的序列多态性，已成为一种探求科内、属内、种间的系统亲缘关系及其物种鉴别的重要分子标记。利用这个片段开展的BLAST比对发现，NCBI上登录了大量尖孢镰刀菌的相应序列，长度500 bp左右，涵盖了多个寄主专化型。这些信息对于利用该片段开展系统发育分析提供了便利[9]。该分子标记技术具有快速、准确、微量、灵敏度高、程序简单等优点，现已广泛应用于真菌的分类鉴定、检测和病害诊断[10]。本研究结果为下一步莲腐败病检测和防治工作的开展打下了基础。
参考文献
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