摘要:KRAB/C2H2型锌指蛋白是一类具有重要功能的转录调节因子.初步克隆了一个新的人类KRAB/C2H2型锌指蛋白基因,经国际基因命名委员会批准命名为ZNF569.此基因在基因组DNA上长约56.28kb.定位于19q13.12.ORF全长2061个碱基,含6个外显子,5个内含子,编码一个长686个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白包含一个KRAB结构域和18个锌指结构域.Northern杂交结果表明,ZNF382mRNA在早期胚胎时期就开始表达,在不同时期人类胚胎组织中广泛表达,包括脑,心脏,肝和骨骼肌.在成人组织中重点表达在心脏,在肝,胰和骨骼肌中也有表达,其结构和表达特征预示着ZNF569在心脏发育和功能的发挥起着潜在的作用.
关键词:ZNF569;心脏发育;KRAB/C2H2;克隆;表达
中图分类号:Q785文献标识码:A文章编号:
人类基因组估计有300-700个锌指蛋白,它们都具有锌指结构域,而C2H2型占绝大多数,此种锌指蛋白含有大约28个氨基酸的重复锌指序列,并由2个半胱氨酸残基和2个组氨酸残基螯合一个锌离子构成,此结构域能结合到特异的DNA识别位点,激活或抑制基因的表达[1].有1/3的C2H2型锌指蛋白同时具有一个KRAB框,此结构域位于锌指蛋白的氮末端非锌指区域,由A框和B框组成,折叠成ɑ-2螺旋参与蛋白质和蛋
基金项目:国家自然科学基金(30270684)、湖南省教育厅一般项目
作者简介:黄欣琼,第一作者(1980.9.),女(汉族),湖南衡阳人,硕士,南华大学医学院组织学与胚胎学教研室讲师,,主要从事心脏发育研究(第一作者E-mail:warnet904@yahoocom.cn,电话:0734-8281388通讯作者:唐显庆,副教授)
白质之间的作用,这种作用大部分是通过与转录中介因子2TIF1相互作用实现的[2].研究表明锌指蛋白在生物发育过程中充当持家基因或调节因子的角色,起着多方面的作用.如ZNF174是某些生长因子基因的负调节子[3],AJ18参与骨的发育[4].许多锌指蛋白参与某些肿瘤的形成,如WT1[5].
本文利用同源基因和5’RACE法克隆了KRABΠ/C2H2型锌指蛋白家族的一个新基因,经国际人类基因命名委员会批准命名为ZNF569.
1材料和方法
1.1cDNA文库的构建
用传统酚Π氯仿抽提的方法从人类胚胎的心脏组织中提取总RNA500μg,用RapidmRNATMpurificationKit(AMRESCO)分离纯化mRNA,以此mRNA为模板,使用TaKaRa公司的cDNASynsisKits和cDNAPCRLibraryKits反转录得到第1条cDNA链,在此基础上合成第2条cDNA链并使其平滑化,经酚Π氯仿抽提、连接、cDNA扩增,获得人类胚胎心脏组织的cDNA文库.
1.2ZNF569基因的克隆
以本实验室提取的心脏mRNA反转录所得的cDNA文库为模板,根据C2H2型锌指基因及相应未知EST序列设计引物P1和P2,其序列分别为P1(5"-AAGAGGAAATGACTGAGTCCCAGGG-3"),P2(5"-TCCTCTGGTGTCTAAC
AAGGTGCGA-3")进行PCR扩增,反应条件为:94℃4min一个循环,(94°C30s,52°C30s,72°C2min)30个循环,72°C8min所得PCR产物与克隆载体pMD18-T16℃连接过夜,转化大肠杆菌DH5,涂板,37℃生长过夜,挑单克隆菌培养,提取质粒,37℃酶切鉴定后,测序分析.
1.35’-RACE-PCR
采用快速扩增cDNA末端(RapidamplificationofcDNAends,RACE)技术在获得基因片段的基础
上设计基因5-RACE基因特异性嵌套引物R1和R2,其序列分别为PRACE1(5"-TCCTGAGTGAAGTCGATAGCCA-3"),PRACE2(5"-TCCTCTGGTGTCTAACAAGGTGCGA-3").用心脏组织mRNA反转录所得的cDNA文库为模板,嵌套PCR引物进行cDNA末端扩增.用琼脂糖凝胶电泳法回收扩增PCR产
物,用T载体连接,转化大肠杆菌DH5.转化后经酶切鉴定和进一步测序分析,最终获得其全长cDNA序列.
1.4Northern印迹膜的制备
用传统的酚Π氯仿抽提方法从15,18,20和23周的人类早期胚胎各组织以及妊娠34d和40d的总胚胎组织中提取总RNA.用DEPC抑制RNA的降解.每一电泳泳道取总RNA20μg进行1%甲醛变性凝胶电泳,使用20×SSC作为转移液,按常规方法转印尼龙膜,结合有RNA的尼龙膜经80℃烘烤2h,紫外灯照射15min.
1.5Northern杂交
利用随机引物标记试剂盒对探针进行[α232p]dCTP标记,将从CLONTECH公司买的成人组织mRNA膜和转有20μg人体胚胎多种组织以及总胚胎组织的总RNA尼龙膜,膜在50%甲酰胺,2×SSC,1%SDS,10%硫酸葡聚糖和0.1mgΠmLHumanDNA的预杂交液中进行42℃预杂交.标记好的探针经变性处理用于杂交.杂交在无甲酰胺的杂交液中68℃杂交过夜.用1%SDS,2×SSC溶液在65℃洗膜2次,每次15min,再用1%SDS,0.2×SSC溶液洗膜2次,每次15min,室温稍晾干后-80℃下放射自显影,根据杂交信号的强弱进行X光片曝光得基因的Northern杂交结果.膜再用0.1×SSC和0.5%SDS在95℃洗10min,用标记过的β2actincDNA重新做Northern杂交进行阳性对照实验.
2结果
2.1ZNF569的全基因克隆及结果分析
利用KRAB/C2H2型基因设计PCR反应引物扩增获得部分基因片段后,在其5’端设计一个嵌套5’RACEPCR的引物进行5’-RACE扩增,结果获得一个长度为558bp的PCR产物(见图1).经纯化,T载体连接,转化,测序,从而获得完整的基因cDNA序列.该基因全长为2061bp,含有6个外显子,全基因在基因组序列上长达56.28kb,其3’端有一个加尾信号AATAAA.此基因共编码686个氨基酸,蛋白质大小约79581.85Dalton(~80kDa).起始密码子开始于559,终止密码子位于2620.此基因编码的蛋白质在氮末端有1个KRAB框,18个C2H2型锌指(ZF),属于锌指蛋白家族的KRABΠ/C2H2亚家族.根据核苷酸和蛋白质的特征,经国际基因命名委员会批准,命名为ZNF569.
2.2ZNF569的进化保守性分析
利用ZNF569的氨基酸序列在NCBI数据库中进行BLASTp搜索,发现各种真核生物中都存在ZNF569的同源蛋白,ZNF470(H.sapiens),ZNF585b(H.sapiens),ZNF84(H.sapiens),ZNF43(H.sapiens),ZNF624(H.sapiens),ZNF74(M.musculus),ZNF184(M.musculus)等的KRAB框与ZNF569的KRAB框蛋白质序列高度保守。而ZNF569蛋白质与鼠ZNF74蛋白的相似度达到94%。ZNF569本身18个锌指结构蛋白质序列也高度保守,进化树分析说明,ZNF569及其同源蛋白构成了一个在进化中高度保守的新的KRAB-ZF基因,而它们的功能尚未见报道。
2.3ZNF569的表达分析
我们利用ZNF569的ORF为探针,用成人组织的mRNA膜(CLONTECH公司)及17周胚胎组织总RNA膜进行的NorthernBlot分析。结果显示,ZNF569基因的转录产物约为2.06kb;在成体心脏,肝,胰和骨骼肌(图2A)及胚胎的脑,心脏,肝和骨骼肌中有不同程度的表达(图2B)。可以看到,ZNF569的表达存在着时期差异。胚胎时期,其表达主要在脑、心脏和骨骼肌,而到了成人期,其表达非常显著的集中在心脏和肝脏。
3讨论
本实验室利用基因的同源性和5’-RACE,克隆了一个新的KRAB/C2H2型的锌指蛋白基因ZNF569,它编码的蛋白含1个KRAB框和18个C2H2型锌指结构.表达模式是研究基因功能的一条重要线索,ZNF569mRNA有选择性地在心脏组织和骨骼肌表达.在胚胎时期ZNF569可在心脏,大脑检测到强的表达,表明ZNF569很可能在早期胚胎分化和胚胎的形成以及心脏的晚期发育或心脏功能的发挥起着重要的作用.ZNF569在心脏发育和心脏发病机理的重要性有待进一步研究.