摘要：2015年冬小麦返青期，山东省青岛市、临沂市的冬小麦出现缺苗断垄现象，叶片出现萎蔫症状，植株矮小，生長不良，毛细根上出现似开水烫过样水渍状病斑，重者小麦根系及茎基部变褐。本研究对其病原菌进行分离培养、致病性测定、形态学观察及分子生物学鉴定。结果表明，引起两地冬小麦根腐病（称为腐霉根腐病）的病原菌为刺腐霉（Pythium spinosum），该病原菌菌落白色，菌丝发达，分枝繁茂。该研究结果可为冬小麦腐霉根腐病防治提供科学依据。
关键词：腐霉根腐病； 刺腐霉； 冬小麦
中图分类号：S435.121.4+7 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）08-0104-04
Abstract A disease was observed on winter wheat in Qingdao and Linyi regions of Shandong Province in 2015. The infected wheat showed wilt leaves， water-soaked roots and dwarf plants， and the seriously infected ones had browned roots and stem bases. Two Pythium-like strains were isolated from the infected wheat roots. Based on their morphology biological characteristics， pathogenicity and ITS sequences， the two strains were all identified as P. spinosum. The colonies were white on CMA， and mycelia developed well. The research results could provide scientific bases for prevention and control of wheat pythium root rot.
Keywords Pythium root rot； P. spinosum； Winter wheat
由腐霉菌引起的小麦根腐病（小麦腐霉根腐病）是世界性病害，现全国均有分布。小麦受到腐霉菌Pythium spp.侵染后，根系常表现为变褐腐烂，地上部分生长不良，产量降低，种子和幼苗在出土前就可霉烂和死亡。我国东北、西北春麦区发生重，黄淮海冬麦区也发生普遍。近年来，山东青岛和临沂莒南地区返青后冬小麦叶片变黄，呈点片发生，发病轻的植株根尖水渍状，似开水烫过，地上部分生长不良。本研究通过病原菌分离、致病性测定、形态学观察并结合腐霉菌株rDNA-ITS序列比对结果，明确引起该地区冬小麦根腐病（称其为小麦腐霉根腐病）的病原菌，以期为该病害发生规律的探究和综合防治措施的制定提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 病害调查与症状观察
2014年2—3月在山东省青岛市农业科学研究院冬小麦试验田和莒南县冬小麦地，对小麦腐霉根腐病的发生和危害情况进行调查，观察记载田间病株症状，采集具有典型症状的冬小麦植株。
1.2 病原菌的分离、培养及纯化
本试验采用组织分离法从具有典型症状的冬小麦根部分离病菌。将病株水渍状细毛根剪成0.5～1.0 cm小段，用自来水冲洗24 h，0.05%次氯酸钙消毒10 min，放入WA平板28℃培养24～48 h，采用单孢分离法进行纯化，转移到CMA培养基上，将纯化好的菌株SDQD-1和SDJN-1保存备用。
WA培养基：琼脂粉18 g，用去离子水混合配制1 000 mL。
CMA培养基：玉米粉60 g，60℃水浴2 h，过滤取滤液，琼脂粉18 g，用去离子水混合配制1 000 mL。
1.3 致病性测定
将SDQD-1和SDJN-1转移到CMA平板上28℃暗培养7～10 d。将沙土和塑料盆用甲醛消毒。将培养好的SDQD-1和SDJN-1菌株接种到灭菌玉米粒上培养7～10 d，制成菌剂。菌剂与灭菌沙土以质量比5∶100混合均匀，装入消毒塑料盆。取健康小麦种子（品种为济麦22）催芽后种植在塑料盆内，每盆种植10粒，10～15℃培养。对照采用灭菌玉米粒。待小麦叶片出现萎蔫症状时，观察小麦植株发病情况，并将根取出，观察并记录根发病情况。取有水渍症状的根，分离致病菌，观察与接种菌是否一致。
1.4 病原菌形态观察
将腐霉菌株在CMA培养基上培养7 d，观察菌落形态特征。将SDQD-1和SDJN-1在WA平板上暗培养2 d后移取边缘菌丝至皮氏（Petris）培养液中，28℃培养2～5 d挑取孢子囊，观察孢子囊形态，测量孢子囊大小。待出现藏卵器、雄器、卵孢子后，观察并记录藏卵器及雄器的形态和着生位置、配合情况及卵孢子的形态特征。每项指标分别观察测量50个。
1.5 病原菌分子生物学鉴定
1.5.1 病原菌DNA提取 将供试菌株接种到CMA培养基上，25℃培养5 d，收集菌丝。采用CTAB法提取和纯化基因组DNA，并置于-20℃冰箱中备用。
1.5.2 ITS基因扩增 PCR反应在ABI 2720 PCR仪上进行。使用50 μL PCR反应体系：缓冲液[KCl 20 mmol， （NH4）2SO4 10 mmol， MgCl2 2 mmol， Tris-HCl 20 mmol， pH 8.4]、dNTPs各200 μmol，真菌rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4各15 pmol，Taq DNA聚合酶（Biocolor BioScience and Technology，Shanghai， China） 2.5 units，模板DNA 100 ng。PCR反应条件：95℃预变性3 min；94℃变性40 s，54℃退火50 s，72℃延伸60 s，共35个循环；72℃延伸10 min。经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。每次反应设不含模板DNA为阴性对照。
1.5.3 PCR扩增产物测序和序列分析 将PCR扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化回收后，送上海生工进行测序。将测序结果在GenBank上与已发表的基因进行同源性比对。
1.5.4 数据分析 运用Mega 5.2.2软件，采用邻接法（neighbor joininig，NJ）对基因序列进行系统分析。
2 结果与分析
2.1 小麦腐霉根腐病的症状特点及致病性测定结果
腐霉菌株能侵染冬小麦种子，出土前就能引起冬小麦种子腐烂，降低出苗率。致病性测定结果表明苗期小麦受到侵染后，根系短小，次生根减少，地上部分矮化，鲜重减轻，能引起第一片叶卷曲，使叶片不能正常伸展（图1）。
2.2 形态特征观察
SDQD-1和SDJN-1菌落在CMA上呈放射状，白色，菌丝发达，无隔，孢子囊球形、近球形，直径9.0～22.0（平均14.5）μm，偶有1～2个乳状突起物，顶生、间生或切生。藏卵器球形、近球形，直径13.3～22.3（平均 18.4）μm，顶生为主，多数壁上均匀密布指状突起物，少数壁上的突起物稀疏，突起物有时稍弯曲，顶端圆钝，高1.4～6.7（平均 4.0）μm，偶尔光滑。雄器多同丝生，雄器细胞棍棒形、弯棍棒形、弯弓形，每个藏卵器与1个（偶尔2～3个）雄器结合，雄器细胞完成受精作用后常消解。卵孢子球形，直径12.8～19.5（平均 16.5）μm，满器，偶尔不满器，每个藏卵器有1个卵孢子。菌株SDQD-1和菌株SDJN-1的形态特征相同，基本符合《中国真菌志》第六卷霜霉目（余永年，1998）中刺腐霉（Pythium spinosum）的特征描述[1]。
2.3 序列分析
经ITS1和ITS4引物对扩增rDNA-ITS序列，从SDQD-1和SDJN-1菌株基因组中扩增均获得924 bp的序列，两者相似性为100%。将SDQD-1序列在GenBank中进行序列一致性比较，结果表明与P. spinosum（GenBank号：HQ643791.1）的ITS序列同源性达99%。
利用Mega5.2.2软件对不同菌株放rDNA-ITS序列进行进聚类分析，结果表明供试菌株SDQD-1与P. spinosum（GenBank号：HQ643791）为同一分支，进化距离最近（图2）。根据病原菌的形态特征及ITS序列同源性比较结果，鉴定SDQD-1和SDJN-1为刺腐霉（P. spinosum）。
3 讨论与结论
Vanterpool最早于19世纪30年代在加拿大发现Pythium arrhenomanes 等常可导致大麦、冬小麦和其他粮食作物的根腐病，此后，许多国家的学者们也相继报道该病害，并对麦作土壤中腐霉，特别是致病腐霉及其引起的病害有广泛的研究，美国和澳大利亚报道比较多，日本也做了不少研究，而国内已报道引起小麦根腐病的病原菌有麦根腐平脐蠕孢Bipolaris sorokiniana、尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum、层出镰孢菌Fusarium proliferatum、黄色镰孢菌Fusarium culmorum等[2]，由腐霉菌引起的小麦根腐病研究的较少。1989—1990年，王政逸等从浙江省各冬小麦产区的病株和麦田土壤中分离鉴定了5个腐霉种，并对其做了致病性研究[3]。余永年等[4]对我国不同植被土壤中腐霉菌种类及其数量分布做了大量研究，认为大田土（包括麦类土等）中腐霉数量仅次于菜田土，并从中分离到了15种腐霉菌；在禾谷类区系中，以瓜果腐霉（P. aphanidermatum）、强雄腐霉（P. arrhenomanes）、禾生腐霉（P. graminicola）和终极腐霉（P. ultimum）较为丰富。经分离和致病性检测，浙江省引起大、小麦根腐病的腐霉菌包括P. dissotocum、 P. irregulare、P. polypapillatum、P. spinosum和P. ultimum 5种，均能引起供试大、小麦的根腐、根褐变和坏死，第一片叶卷曲，植株矮小的症状[5]，与本试验致病性测定时症状相似。
本研究从山东青岛和莒南县冬小麦区感病小麦的植株根部分离的病原菌均能致病，经形态和分子鉴定为同一个种，即刺腐霉（P. spinosum）。有关该病害的发生流行规律、侵染循环及防治措施等還需进一步研究。
参考文献：
[1]余永年. 中国真菌志（第六卷.霜霉目）[M]. 北京： 科学出版社， 1998.
[2]张德珍， 李鹏昌， 陈晓霞，等. 山东省小麦根腐病病原菌的分离鉴定[J]. 植物保护学报， 2016， 43（2）： 233-240.
[3]王政逸， 张炳欣， 楼兵干. 浙江省小麦根围土壤腐霉（Pythium spp.）的一些生态学研究[J]. 植物病理学报， 1996， 26（1）： 29-35.
[4]余永年， 马国忠， 刘晓娟. 腐霉属分类性状评价及其中国的种[J]. 真菌学报， 1990， 9（4）： 249-262.
[5]沈杰， 张炳欣. 浙江省大、小麦致病腐霉的研究[J]. 植物病理学报， 1994， 24（2）： 107-112.