四物汤对Caco—2细胞P—糖蛋白功能和表达的影响

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[摘要] 研究四物汤对Caco-2细胞P-糖蛋白（P-gp）功能和表达的影响。采用实时定量聚合酶链式反应（Q-PCR）分析Caco-2细胞上MDR1基因mRNA的表达量;采用流式细胞仪检测经四物汤水煎液处理后Caco-2细胞对罗丹明123摄取量的影响，以评价P-gp的外排功能;采用Western blotting法检测四物汤水煎液对Caco-2细胞P-gp蛋白表达量的影响。与空白对照组比较，四物汤水煎液3.3，5.0，10.0 g·L^-1孵育Caco-2细胞24，48，72 h对MDR1基因mRNA的表达量具有上调作用，表明四物汤水煎液对MDR1具有诱导作用;四物汤水煎液作用于Caco-2细胞48 h后，细胞内罗丹明123的摄取量分别减弱了16.6%，22.1%（P<0.05），45.4%（P<0.01），提示长期应用四物汤水煎液，可增强Caco-2细胞P-gp的外排功能;四物汤水煎液孵育Caco-2细胞48 h后，上调了Caco-2细胞膜上P-gp蛋白表达量，表明四物汤水煎液对P-gp的蛋白表达量具有诱导作用。

[关键词] 四物汤;P-gp;MDR1;Caco-2细胞;罗丹明123

[收稿日期] 2014-06-24

[基金项目] 国家自然科学基金重点项目（81130067）;国家自然科学基金面上项目（81073028，81274127）

[通信作者] 高月，博士，研究员，Tel：（010）66931312，E-mail：gaoyue@nic.bmi.ca.cn;黄先菊，博士后，教授，Tel：（010）66930267，E-mail： huangxianju1972@yahoo.cn

[作者简介] 蒋逸，硕士研究生，Tel：（010）66930267，E-mail： jiangyizy@126.com

Effect of Siwu decoction on function and expression of

P-glycoprotein in Caco-2 cells

JIANG Yi， MA Zeng-chun， HUANG Xian-ju， YOU Qing， TAN Hong-ling， WANG Yu-guang， LIANG Qian-de， TANG Xiang-lin， XIAO Cheng-rong， GAO Yue

（1.College of Pharmacy， South-Central University for Nationalities， Wuhan 430074， China;

2. Institute of Radiation Medicine， Academy of Military Medical Sciences， Beijing 100850， China）

[Abstract] To study the effect of Siwu decoction on the function and expression of P-glycoprotein （P-gp） in Caco-2 cells. The Real-time quantitative poly-merase chain reaction （Q-PCR） was used to analyze the mRNA expression of MDR1 gene in Caco-2 cells. Flow cytometer was used to study the effect of Siwu decoction on the uptake of Rhodamine 123 in Caco-2 cells， in order to evaluate the efflux function of P-gp. Western blotting method was used to detect the effect of Siwu decoction on the P-gp protein expression of Caco-2 cells. Compared with the blank control group， after Caco-2 incubation with Siwu decoction at concentrations of 3.3， 5.0， 10.0 g·L^-1 for 24， 48， 72 h， the mRNA expression of MDR1 was up-regulated， suggesting the effect of Siwu decoction in inducing the expression of MDR1. After the administration with Siwu decoction in Caco-2 cells for 48 h， the uptake of Rhodamine 123 in Caco-2 cells decreased by respectively 16.6%， 22.1%（P<0.05） and 45.4%（P<0.01）， indicating that the long-term administration of Siwu decoction can enhance the P-gp efflux function of Caco-2 cells. After the incubation of Caco-2 cells with Siwu decoction for 48 h， the P-gp protein expression on Caco-2 cell emebranes， demonstrating the effect of Siwu decoction in inducing the protein expression of P-gp.

[Key words] Siwu decoction; P-gp; MDR1; Caco-2; Rhodamin 123

doi：10.4268/cjcmm20150528

P-糖蛋白（p-glycoprotein，P-gp） 是一个由约1 280个氨基酸组成的能量（ATP）依赖性转运蛋白，分布在人体很多正常组织中，如肠道、肝、肾以及血脑屏障胎盘屏障的上皮细胞，它能将P-gp底物药物逆向转运出细胞，降低药物在细胞内的浓度，减少药物对细胞组织的损伤，此外，肠黏膜P-gp能够将底物药物由肠上皮细胞逆转运药物到肠腔中从而降低了药物在肠道的吸收，影响药物的口服生物利用度[1-2]。

四物汤首见于宋代《太平惠民和剂局方》，由熟地黄、当归、白芍、川芎组成，为经典的补血之基础方，由四物汤衍生的桃红四物汤[3]、人参四物汤[4]和参芪四物汤[5]等，在现在临床上发挥着重要的作用;现代研究表明，四物汤在免疫、血液、心血管、抗放和对抗化学药物的毒性都有很好的调节作用[6]。根据文献报道，P-gp抑制剂能够改善芍药苷的体外吸收[7];川芎嗪受到P-gp的外排作用，并对P-gp的表达有抑制作用[8-9]，阿魏酸对P-gp具有诱导作用[10]等。上述化合物在四物汤中为治疗血虚证的重要活性化合物，同时它们都受到P-gp的调节作用，并作为一个整体被吸收、代谢、分布、发挥疗效;查阅文献发现四物汤在转运体中发挥的作用并没有相关报道，本实验立足四物汤对P-gp转运体功能和表达的影响，采用人类结肠癌细胞系Caco-2细胞模型，研究了四物汤对P-gp的综合调节作用，为四物汤及其衍生方的临床应用提供参考依据。

1 材料

1.1 细胞 Caco-2细胞购买于中国协和医科大学基础医学细胞中心，实验室用的细胞代数为40～60代。

1.2 试剂与药品 MEM培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素、非必须氨基酸（NEAA）（Hyclone）;0.25%胰蛋白酶-EDTA、L-谷氨酰胺、罗丹明-123（Sigma公司）;MTS试剂盒（Promega公司）;四物汤由熟地黄、当归、白芍、川芎组成，全部药物均购自安徽亳州同仁堂中药厂（由军事医学科学院二所九室马百平研究员鉴定）;盐酸普萘洛尔、利福平（中国食品药品检定研究院）;MDR1，GAPDH引物（Invitrogen公司）;P-gp单抗（Thermo公司）;HRP标记山羊抗鼠lgG （康为世纪有限公司）;QPCR试剂盒（ABI）。

1.3 仪器 流式细胞仪（美国Becton-Dickinson FACS caliber 公司）;Western blotting电泳仪、湿转膜仪（美国Bio-Rad公司）;PVDF膜（美国Millpore公司）;StepOnePlus Real-time PCR系统（Applied Biosystems）;CO₂培养箱（SANYO MCO20-AIC）;ChemiScope Mini化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）。

2 方法

2.1 供试样品的制备 四物汤水煎液按《太平惠民和剂局方》规定的剂量称取组成，熟地黄15 g，当归10 g，白芍10 g，川芎6 g，共计41 g。加入适量的蒸馏水，浸泡1 h，按1∶8倍体积比加入蒸馏水，水煎微沸1 h，6层纱布过滤，药渣再加入5倍体积的蒸馏水，水煎微沸30 min，过滤，合并2次滤液，抽滤后旋转蒸发浓缩成100%药液（即每1 mL药液含生药1 g）。

2.2 细胞培养 Caco-2细胞复苏后以2×10⁵个/mL密度接种于25 cm²的细胞培养瓶中，加入5 mL含10%FBS，1%谷氨酰胺，1%非必需氨基酸，0.1 U·L^-1青霉素-链霉素双抗的不完全MEM培养基。细胞在37 ℃，5%CO₂的培养箱中培养，隔天换液，待细胞生长至80%～90%时用0.25%胰酶消化并传代，选取对数生长期的Caco-2细胞用于实验。

2.3 药液安全浓度的考察 使用MTS试剂盒检测四物汤水煎液给药24，48，72 h后Caco-2细胞的存活率。将细胞密度为2×10⁴个/cm²接种到96孔板中，每孔200 μL，于37 ℃，5%CO₂细胞培养箱中培养24 h后，小心吸尽培养液，加入配置不同浓度的四物汤水煎药液（含生药质量浓度为0.625，1.25，2.5，5，10，20 g·L^-1）200 μL，空白培基为对照组，每组设置6个复孔，在37 ℃，5%CO₂细胞培养箱中分别孵育24，48，72 h后，每孔加入8 μL MTS，在细胞培养箱中继续孵育3 h，然后在多功能酶标仪检测490 nm处的吸光度（A）。按下列公式计算细胞的相对存活率=（A_实验组-A_{溶剂对照组}）/（A_{空白对照组}-A_{溶剂对照组}）×100%。

2.4 荧光定量PCR检测MDR1基因的表达 将对数生长期Caco-2细胞分为四物汤水煎液（SWT）不同剂量组（3.3，5.0，10.0 g·L^-1）、维拉帕米（Ver，100 μmol·L^-1）、利福平（Rif，20 μmol·L^-1）阳性对照组、空白对照组（细胞培养基）。受试药分别作用于Caco-2细胞24，48，72 h后收集细胞。利用Trizol试剂提取细胞总RNA。紫外分光光度计法测定RNA浓度，测定吸光度A<sub>260/A<sub>280的比值，测定值在1.8～2.0，说明制备的总RNA 较为纯净。以2 μg RNA 为模板，加入到20 μL RT反应体系中，按照反转录试剂盒操作制备cDNA，Q-PCR具体操作参照说明书进行，荧光实时定量PCR扩增的循环条件为95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环。以GAPDH作为内参基因，进行PCR扩增的实时定量分析。mRNA表达水平采用比较阈值法进行定量分析[11]。特异性引物序列见表1，引物特异性由BLAST评价，溶解曲线检测，表明引物特异性强。

2.5 流式细胞仪检测Caco-2细胞P-gp外排功能 给药分组与2.4项相同。分别于37 ℃，5%CO₂培养箱中用含药培养基中培养1，48 h，PBS洗2次，弃上清，用胰酶消化，收集细胞转入1.5 mL EP管中，4 ℃下2 500 r·min^-1离心5 min，弃上清，PBS洗2次，离心弃上清。每管加入罗丹明123（终浓度为10 μmol·L^-1），重悬后在37 ℃，5%CO₂培养箱中培养60 min，置冰上终止作用，4 ℃下2 500 r·min^-1离心5 min，弃上清，用预冷的PBS洗2次，离心弃上清。加PBS 300 μL轻轻吹打，制成单个细胞悬液。在激发波长为466 nm、发射波长为535 nm条件下选择FITC通道测定2万个细胞，收集535 nm处的罗丹明123荧光进行分析，分析时除去细胞碎片和细胞团块对测定的干扰，实验重复3次。按下列公式计算罗丹明123的相对荧光强度=A_实验组/A_{空白对照组}×100%。

2.6 Western blotting法检测P-gp的表达 给药方案与2.4项相同，加药后在37 ℃，5%CO₂培养箱培养48 h，用PBS洗2次，弃上清，用裂解液RIPA裂解细胞，提取总蛋白，按试剂盒方法操作，绘制标准曲线并计算各样品中蛋白的量。SDS-PAGE蛋白质电泳，每个样品取含蛋白60 μg的体积，进行电泳，转膜，5%BSA封闭1 h，anti-P-gp仓鼠单抗（一抗）孵育过夜，TBST洗涤3次，辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG（二抗）孵育1 h，TBST洗涤3次，使用ECL试剂盒至PVDF膜上显出清晰的条带，用ChemiScope Mini系统成像。

2.7 统计分析 统计用GraphPad 5.0 统计学软件处理，用±s表示，组间差异采用t检验。

3 结果

3.1 四物汤水煎液安全浓度的考察 四物汤水煎液在相当于含生药质量浓度为0.625～10 g·L^-1相对存活率大于90%，表明药液在0.625～10 g·L^-1为安全浓度，见图1，所以受试药液质量浓度在0.625～10 g·L^-1考虑。

3.2 对Caco-2细胞MDR1基因的影响 本实验考查了3个不同时间点四物汤水煎液对MDR1基因的影响，与对照组比较，3个时间点中维拉帕米和利福平阳性对照组具有统计学意义（P<0.05），表明重复实验具有可靠性;与空白对照组比较，3个时间点中各浓度四物汤水煎液组对P-gp mRNA具有不同程度的上调作用，表明四物汤水煎液在mRNA水平对P-gp具有诱导作用，其中在给药48 h实验结果较为稳定，且不同浓度的四物汤水煎液都有统计学意义，下步实验将选择四物汤水煎液作用Caco-2细胞48 h分别考查其对P-gp功能活性和蛋白表达水平的影响，见图2。

3.3 对Caco-2细胞P-gp外排功能的影响 与对照组相比，四物汤水煎液3.3，5.0，10.0 g·L^-1作用于Caco-2细胞1 h后，胞内罗丹明123的荧光强度影响不大，无统计学意义，表明四物汤水煎液在短时间内对Caco-2细胞P-gp的功能活性没有影响;3个不同浓度的四物汤水煎液作用于Caco-2细胞48 h后，细胞内罗丹明123的荧光强度分别减弱了16.6%，22.1%（P<0.05），45.4%（P<0.01），表明四物汤水煎液对Caco-2细胞P-gp具有诱导作用，见图3。

3.4 对Caco-2细胞P-gp蛋白表达的影响 用Western blot分析P-gp蛋白表达，与对照组相比，P-gp抑制剂维拉帕米显著降低P-gp蛋白表达，利福平显著诱导了P-gp蛋白表达，四物汤水煎液对P-gp蛋白有显著诱导效应，见图4。综合之前的罗丹明123外排和MDR1基因表达结果，表明四物汤水煎液能够通过诱导MDR1基因的表达来增加P-gp蛋白表达，进而增强P-gp的功能。

4 讨论

本实验室前期从全方、有效部分、有效成分3个化学层次和整体、器官、细胞及分子4个药理水平，基本阐明了补血名方四物汤的药效物质基础，并重构了基于有效成分的新组方，首次发现了果糖和芍药苷的补血活性[12-14]，本文深入到药物代谢动力学领域，初步探讨四物汤可能对机体产生的效应。选择公认的P-gp的阳性抑制剂维拉帕米组，同时设置P-gp的阳性诱导剂利福平组[15]，并通过Q-PCR筛选可靠稳定的时间点，考查了四物汤水煎液对P-gp的功能和表达影响。

结果表明，经过48 h的长时干预，四物汤水煎液高、中、低浓度能提高了Caco-2细胞膜上P-gp基因表达的水平，增强了Caco-2细胞P-gp的外排功能，而在四物汤水煎液干预1 h，对P-gp的功能影响不是很明显，提示四物汤水煎液在一定的浓度范围，其长期干预能上调Caco-2细胞膜上P-gp的表达水平，四物汤水煎液的作用在该浓度范围呈浓度依赖性的倾向，并提示了四物汤短时间内，对P-gp的功能影响不大，在临床上可以考虑合理的搭配联合用药。

四物汤的化学成分分析表明，四物汤的物质基础丰富，糖类、阿魏酸、川芎嗪和芍药苷为其治疗血虚证的主要活性成分[16]，同时也有文献报道，川芎嗪不仅被P-gp外排，同时对P-gp具有抑制作用[8]，另外高利臣[10]研究表明，阿魏酸对P-gp具有诱导作用，而从四物汤化学成分含量表明阿魏酸的含量要比川芎嗪的要高很多，故猜测可能是四物汤水煎液中的阿魏酸对P-gp起主要作用，这个信息为下步实验提供一定方向性。

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[责任编辑 张宁宁]