摘 要 在海南省儋州市的三药槟榔（Areca triandra Roxb）苗圃中发现一种为害严重的叶斑病。根据该病的病原菌形态特征以及ITS序列分析，鉴定该病原为克卢亚拟盘多毛孢菌[Pestalotiopsis clusiae（Griffon&Maubl）]。病原生物学特性分析发现，该病原菌菌丝生长的适宜温度为28 ℃，pH为6.5，适宜的碳源为 D-麦芽糖和D-葡萄糖，适宜氮源为硝酸钾和硝酸钠；光暗交替有利于菌丝生长及产孢；孢子萌发的适宜温度为30 ℃，pH为5.5，孢子致死温度为50 ℃，10 min。采用含毒介质法对4种药剂进行室内敏感性测定，发现该病原菌菌丝生长对50%多菌灵（WP）敏感性最高，50%异菌脲次之。
关键词 三药槟榔；叶斑病；拟盘多毛孢菌；生物学特性
中图分类号 S792.91 文献标识码 A
Identification and Biological Characteristics
Analysis on the Pathogen of Areca triandra
LI Boxun1，WANG Yanli1，XIE Changping2，SHI Tao1，HUANG Guixiu1*
1 Environment and Plant Protection Institute，China Academy of Tropic Agricultural Sciences/ Key Laboratory of
Integrated Pest Management on Tropical Grops，Ministry of Agriculture，P.R.China/Hainan Key Laboratory
for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests，Haikou，Hainan，571101，China
2 Environment and Plant Protection college，Hainan University，Haikou，Hainan 570228，China
Abstract Areca triandra（Areca triandra Roxb.）Pestalotiopsis leaf spot is an important disease in A. triandra， which can affect the growth and ornamental value of A. triandra. The pathogen was identified P. clusiae（Griffon&Maubl）by biological characteristics and molecular biology. The optimal temperature for mycelium growth was 28℃ and for conidial germination was 30 ℃，however the temperature higher than 50 ℃ was not beneficial for conidium. Acidic conditions conducive to the growth of pathogen， the optimal pH values for mycelium growth was 6.5 and for conidial germination was 5.5. 4 fungicides was screened in laboratory by hypha growth rate method. Carbendazim 50%WP and 50% Iprodione EC could restrain effectually the growth in Lab.
Key words Areca triandra；Pestalotiopsis clusiae；Pathogen identification；Biological characteristics.
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.025
三药槟榔（Areca triandra Roxb.）又称为三雄芯槟榔，属棕榈科槟榔属植物；原产于印度、马来西亚等国家的热带地区，20世纪60年代引入中国，随后被广泛种植于华南、西南及沿海地区[1]。三药槟榔株型高大，气势雄伟，青翠浓绿、优美壮观，富有浓烈的热带风光气息，为南方热带园林绿化工程中不可缺少的优良树种[2]。近年来，笔者在海南省儋州市的许多三药槟榔树上均发现了一种叶斑病，该病主要为害三药槟榔叶片，病斑为灰白色、边缘呈黑褐色坏死，密集且连接成片，导致叶片枯萎、倒垂。在随后的调查中发现，该病在海南海口、儋州、三亚的三药槟榔上都普遍发生，叶片发病率已达70%～80%，严重影响了三药槟榔的观赏价值。目前关于三药槟榔病害的研究国内外都鲜有报道。但有报道说在棕榈科其他属的植物如椰子、加拿利海枣[4]、大王棕、华棕[5]、散尾葵等[6]上发现由拟盘多毛孢病菌（Pestalotiopsis sp）侵染所造成的病害，这些病害的发病症状与三药槟榔叶斑病的症状比较相近，它们的致病菌是否相同或者是否能够交互侵染还需进一步的验证。鉴于目前报道的有关棕榈科植物的研究仅限于对病原菌的鉴定，关于其病原的生物学特性及防治策略并未见更深入的研究和报道。为了更好地预防和控制该病的发生及为害，掌握该病的发生规律及流行条件，本研究对海南地区三药槟榔的主要种植区进行三药槟榔叶斑病的调查，并对其病原进行了鉴定，同时进行生物学特性分析和防治药剂的筛选，为生产上防治该病害提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病样来源 样品采自海南省儋州市三药槟榔苗圃。采集具有典型症状特点的三药槟榔病叶样品，保湿备用。
1.1.2 供试培养基 供试培养基PDA的配制参照方中达[7]的方法。Richards培养基配方：KNO3 10 g；KH2PO4 5 g；MgSO4·7H2O 2.5 g；FeCl2 0.02 g；蔗糖50 g；水1 000 mL。
1.1.3 试剂、引物及菌株 DNA 片段回收试剂盒、 pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司；Taq 酶、dNTP等生化试剂购自天根生化科技（北京）有限公司；rDNA ITS序列分析通用引物为 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），由北京六合华大基因有限公司合成；大肠杆菌JM109感受态细胞由本实验室制备，其它试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 病菌分离、纯化及其致病性测定 采用常规组织分离法和琼脂平板稀释法[7]对田间自然发病的典型三药槟榔叶片进行病原菌的分离及纯化。在田间选取健康的三药槟榔叶片，依照柯赫氏法则[4]将分离纯化后的病原菌进行致病性测定，以不含病原菌的PDA培养基为对照，每个处理3个重复，将样品置于28 ℃中保湿培养，待其发病后从发病部位重新分离病原菌并观察菌落形态特征以及分生孢子形态，用最初分离得到的菌株作对比，确认分离物的致病性。
1.2.2 病原鉴定 （1）形态学鉴定：根据病原菌在PDA培养基上的菌落形态、菌丝颜色等特征来鉴定。用Nikon Eclipse 80i 显微镜（Tokyo，Japan）对分生孢子的形态、颜色、大小、附属丝长度等进行描述，用附带的ACT-1软件和DXM1200F相机进行拍照记录。
（2）rDNA -ITS序列分析：采用CTAB方法[8]提取病原菌DNA。参照裴月令等[9]的方法，用rDNA ITS序列分析通用引物ITS1和ITS4，对病原菌目的基因进行PCR扩增，扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，按照试剂盒说明书对目的条带进行回收和克隆，筛选阳性克隆转化子，随机挑取3个阳性克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定。将已测定得到的序列在NCBI中进行Blast比对。
1.2.3 生物学特性分析 （1）病原菌基础生物学特性测定。①病原菌菌丝生长特性测定：将供试病原菌在PDA培养基平板上于28 ℃培养5 d，用无菌的打孔器在菌落边缘打取直径为4.5 mm的菌龄相同的菌饼备用。调节PDA培养基的pH至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和9.5后分别制成平板；用等量的碳源（蔗糖、葡萄糖、D-木糖、D-山梨醇、D-乳糖、D-果糖、D-麦芽糖和肌醇）及氮源（硝酸钾、硝酸钠、硝酸铵、硫酸铵、氯化铵、和草酸铵）依次替换Richards培养基中的蔗糖和硝酸钾，以不加任何碳源（蔗糖）和氮源（硝酸钠）的Richards培养基作为对照，灭菌后，制成平板备用。分别将病原菌菌饼接种到不同pH，不同碳、氮源的PDA培养基平板中央，每个处理3个重复，将平皿置于28 ℃恒温培养。另外将病原菌菌饼转移到干净的PDA培养基平板中央，分别置于10、15、20、25、28、30、35、40 ℃的恒温培养箱以及完全光照、光/暗交替和完全黑暗的28 ℃恒温箱中培养。每个处理3个重复，4 d后观察各培养条件下菌丝的生长情况，用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长速率，用SAS软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 病菌分离及其致病性测定
三药槟榔拟盘多毛孢叶斑病主要为害叶部，尤其是下层叶片。发病初期在叶片上出现黑褐色圆形或不规则形的病斑，病斑边缘有黄色晕圈；随着病斑逐渐扩大，向两端延伸呈椭圆形或近圆形，病斑边缘呈黑褐色，中央变为灰褐色，病斑边缘有黄色晕圈；后期多个病斑连接成片，形成不规则的大型病斑，病斑边缘黑褐色，中央灰白色，其上散生许多小黑点，黄色晕圈不限于病斑边缘（如图1A～C）。于田间采集病样，从病健交界处分离病原菌，将病原菌进行单孢纯化后保存备用。病菌编号为AtCP-1。
按照柯赫氏法则[11]将AtCP-1菌株进行致病性测定，结果表明，AtCP-1菌株侵染三药槟榔叶片后的发病症状与田间自然发病的症状相同，再从发病叶片上将病原菌进行分离，所得病原菌在PDA培养基上的菌落形态以及分生孢子的形态特征，与在田间自然发病得到的病原菌形态特征一样，证实该分离菌为三药槟榔叶斑病致病菌（如图1-D）。
2.2 病原鉴定
2.2.1 形态学鉴定 病原菌在PDA培养基上的菌落形态呈圆形、边缘整齐；菌丝为纯白色、生长旺盛，棉絮状、中部稍隆起（图2-A），菌落背面有橘红色色素，在PDA培养基上培养8 d后产孢，产孢后菌落背面无明显的产孢轮纹；分生孢子群落为黑色，不规则地散生于气生菌丝上（图2-B）。显微镜观察发现，三药槟榔拟盘多毛孢叶斑病病原菌的分生孢子为长梭形，有的稍微弯曲，每个分生孢子是4隔5细胞；分生孢子大小为[（19.42～25.32）（21.64）]μm×[（5.70～7.91）（6.85）]μm（随机测量100个分生孢子），中间3个细胞均为褐色，成熟的有色胞第一色胞颜色略浅，浅褐色，第二色胞颜色最深，深褐色，第三色胞次之；有色胞长12.90～15.89（13.89）μm。顶胞和尾胞均为三角形，无色透明；顶胞上着生无色附属丝，2～3根，长20.41～25.91（22.82）μm；尾胞上着生一根基部附属丝，中生，长3.20～6.80（4.90）μm（图2-C）；芽管是从第三个有色胞侧面萌发。参照张家祥[12]的研究结果从形态上将该病原菌鉴定为半知菌类、腔孢纲、黑盘孢目、拟盘多毛孢属的克卢亚拟盘多毛孢菌 [Pestalotiopsis clusiae（Griffon&Maubl）]。
2.2.2 rDNA ITS序列分析 对该病原菌的DNA进行PCR扩增，获得一条约0.5 kb的扩增产物，经克隆和测序可知该序列全长509 nt，将该序列提交NCBI数据库，获得序列登录号：KF811605。经Blast比对分析发现，该序列与数据库中已登录的Pestalotiopsis clavispora（JX875596.1）Pestalotiopsis foedans（JN943631.1）拟盘多毛孢病菌ITS序列的同源性高达100%。
2.3 病原菌生物学特性分析
2.3.1 病原菌基础生物学特性测定 根据病原菌菌丝和分生孢子生长特性测定结果发现，AtCP-1拟盘多毛孢菌菌丝生长的适宜温度是28 ℃，低于15 ℃或高于35 ℃，菌丝生长受抑制或不能生长（图3-A）；适宜的pH值为6.5（图4-A）；光/暗交替培养最有利于病原菌生长（图5）；该菌在含D-乳糖的培养基中其菌丝生长最快，但菌丝稀疏，生长力不旺盛，在含有D-麦芽糖和D-葡萄糖的培养基中菌落的生长状况最好，菌丝致密旺盛，生长速度快，说明D-麦芽糖和D-葡萄糖是该菌生长的最适碳源（图6-A）。该病原菌对硝酸盐类的利用情况明显优于铵盐类，在含硝酸钾和硝酸钠的培养基上生长的速度最快（图6-B），菌丝浓密，是该菌生长的最适氮源。
分生孢子萌发的适宜温度范围在25～30 ℃之间，最适温度是30 ℃，低于10 ℃或高于40 ℃时孢子萌发率都很低（图3-B）；适宜pH范围在3.5～5.5之间，最适pH为5.5（图4-B）。将孢子置于50 ℃水浴锅中处理10 min后孢子不能萌发，说明孢子致死温度为50 ℃
2.3.2 病原菌对室内药剂的敏感性测定 各供试药剂浓度对数与生长抑制率几率值之间表现出线性相关，其浓度对数——生长抑制率几率值的毒力回归方程见表2。从表中可以看出，4种药剂中，病原菌菌丝生长对50%多菌灵（WP）敏感性最强，EC50为0.107 6 mg/L；50%异菌脲次之，EC50为2.233 9 mg/L。与前2种药相比，代森锰锌和腈菌唑的抑菌效果相对较差，建议生产上使用多菌灵和异菌脲对该病进行防治。
3 讨论
棕榈科植物是世界热带地区最主要的油料作物和观赏植物，有着广阔的发展前景。近10年来随着城市绿化事业的发展，棕榈科植物已成为了不可或缺的园林绿化资源。三药槟榔作为其中1种重要的绿化苗木在中国的华南、西南以及沿海地区广泛种植，成为美化城市环境主要的绿化植物。笔者2008年8月在海南省儋州市的三药槟榔苗圃地发现三药槟榔叶斑病的为害，植株发病率达70%～80%，经分离纯化得到了1株三药槟榔拟盘多毛孢叶斑病菌AtCP-1，经鉴定知该病原菌与张家祥等[12]报道的克卢亚拟盘多毛孢菌[Pestalotiopsis clusiae（Griffon&Maubl）]的形态特征及培养性状极为相近。通过对其生物学特性及药剂敏感性测定可知，该病原菌生长适宜的温度、pH分别为28 ℃、6.5，以D-麦芽糖和D-葡萄糖为最佳碳源，硝酸钾和硝酸钠为最佳氮源；孢子萌发适宜的温度和pH分别为30 ℃、5.5。该病原菌可影响植株的长势和观赏性，其在田间典型的发病症状是病斑中央灰白色边缘的黑褐色坏死线周围有明显的黄色晕圈，人工接种的叶片发病症状和田间自然发病的症状略有差异，但是均能形成坏死斑和明显的黄晕。保湿培养能在病斑中央看到黑色小颗粒状突起，为病原菌的分生孢子。
目前有关棕榈科植物病害的研究和报道都较少。2000年金亮等[4]发现厦门地区棕榈植物出现相关病害，经调查发现拟盘多毛孢病菌（Pestalotiopsis sp）能侵染为害加拿利海枣、椰子、散尾葵、酒瓶椰子、棍棒椰子等棕榈科植物。吴丽民等[5]通过症状比对和切片观察共鉴定了大王棕、华棕、刺葵和海枣上由拟盘多毛孢病菌（Pestalotiopsis sp）引起的4种病害。李建宏等[6]发现由小孢拟盘多毛孢[Pestalotiopsis microspora （Speg.）Satista & Peresapud Batista]侵染引起的散尾葵叶斑病在海口地区发病严重。尽管该类病原菌在棕榈科植物上普遍发生为害，但在已有报道中，有关该类病原菌的研究仅限于对病原菌进行鉴定，而关于该病原菌的深入研究以及防治策略都鲜有报道。本研究对AtCP-1的生物学特性进行测定发现其与枇杷、芒果、桂花等经济作物上报道的拟盘多毛孢病菌的生物学特性相似[13-15]，偏酸性和高温高湿的环境有利于该病原菌的生长和孢子的萌发。7～8月是该病发病的高峰期，与此时期的高温多雨天气有利于病原菌的传播和扩散有关，再加上该病原菌寄主范围较广，能为害除三药槟榔以外的其他棕榈科植物如椰子、油棕、散尾葵等。
为了更好的控制该病害的发生，同时也避免该病原菌传播到其他观赏植物上，本研究对4种化学药剂进行了室内毒力测定，结果发现50%多菌灵（WP）的抑菌效果最好，其次是50%异菌脲，84%代森锰锌WP和12.5%腈菌唑EC的抑菌效果较差。通过与杨秀娟等[13]和管斌等[16]得出的枇杷和红叶石楠上拟盘多毛孢病菌的室内、外毒力测定结果对比发现，拟盘多毛孢病原菌对氨基甲酸酯类和咪唑类杀菌剂的敏感性最高，而对三唑类和二甲酰亚胺类的杀菌剂敏感性较低。综合考虑药剂在环境中的降解性能、药剂的防效和成本，笔者推荐采用多菌灵和异菌脲作为生产上防治三药槟榔拟盘多毛孢叶斑病的首选药剂。通过对三药槟榔拟盘多毛孢叶斑病菌的生物学特性及防治药剂的筛选等分析研究，能更好地了解该病的发病条件、流行关键生态因子，同时为该病害的防治提供理论参考，也为由拟盘多毛孢病菌引起的其他棕榈科植物的病害防治提供参考依据。
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