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摘要：为研究鸭防御素的真核表达，人工合成了鸭防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12基因，并将其插入到真核表达质粒pDoubleEx-EGFP-flag-N中构建重组表达质粒；重组表达质粒经酶切鉴定正确后，分别转染HEK293细胞进行表达，用RT-PCR和Westem-blot鉴定目的基因的表达情况。结果表明，酶切鉴定证实目的基因成功插入到真核表达质粒中；真核表达质粒转染HEK293细胞24 h后，在荧光显微镜下可见绿荧光蛋白表达；RT-PCR能检测到目的基因mRNA，但Western-blot没有检测到目的蛋白的表达条带。
关键词：鸭防御素；真核表达；HEK293细胞
中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）24-6597-04
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.068
由于抗生素易导致药物残留、病原耐药性等问题，人们希望研发出安全有效的抗菌肽类药物，替代部分抗生素的使用。禽类防御素（Avian beta defensin，AvBD）作为一类重要的内源性抗菌肽，具有广谱的抗菌活性和免疫调节功能[1]，在禽类先天性免疫和获得性免疫中均发挥着重要作用。因此，禽类防御素极具新药开发价值，有望用于畜禽疾病的防控。
目前，人们已在家禽及某些野禽中发现了数十种禽类防御素，并且在大肠杆菌或酵母菌中成功表达了多种禽类防御素。然而，关于禽类防御素在动物细胞中表达的报道却很少。理论上，动物细胞能为表达蛋白提供更好地表达后加工和修饰，是表达具有天然活性蛋白的最佳宿主[2]。如果能用动物细胞表达禽类防御素，将为禽类防御素的研究和应用提供帮助。本研究根据GenBank中已发布的鸭防御素基因序列，人工合成了3种鸭防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12基因，并构建其真核表达载体，在HEK293细胞中进行了表达研究，为鸭防御素在动物细胞中的表达提供了参考。
1 材料与方法
1.1 细胞、菌株与质粒
HEK293细胞及真核表达质粒pDoubleEx-EGFP-flag-N由长沙赢润生物技术有限公司提供；大肠杆菌DH5？琢感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；表达猪β防御素1（PBD1）的重组质粒pDoubleEx-EGFP-flag-N-PBD1由武汉市农业科学技术研究院畜牧兽医科学研究所构建。
1.2 主要试剂
限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker和蛋白质Marker等分子生物学试剂购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、RNA提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；质粒小提试剂盒购自OMEGA公司；flag标签抗体购美国CMC公司；HRP标记羊抗小鼠IgG二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；转染试剂Lipofectamin 2000购自Invitrogen公司；PCR用试劑购自南京诺唯赞生物科技有限公司；牛血清和细胞培养基为Gibco公司产品；其他常规试剂为分析纯。
1.3 方法
1.3.1 鸭防御素基因的人工合成 根据GenBank上公布的序列信息，人工合成鸭防御素AvBD2（登录号AY641439.1）、AvBD10（登录号XM_005028240.1）
和AvBD12（登录号KR018387.1）基因片段，并在基因片段两端引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。基因合成后连接大肠杆菌克隆载体pUC57-Simple，测序验证合成的序列是否正确。
1.3.2 重组表达质粒的构建 根据设计的酶切位点将合成的基因片段进行双酶切，用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后的基因片段。同法回收酶切后的真核表达质粒，按如下反应体系和条件进行连接反应：10×T4 DNA Ligase Buffer 1.0 μL，T4 DNA Ligase 1.0 μL，回收的pDoubleEx-EGFP-flag-N质粒0.7 μL，回收的AvBD基因片段7.3 μL，总反应体积10.0 μL，16 ℃恒温水浴中连接过夜。
1.3.3 重组表达质粒的提取与酶切鉴定 取大肠杆菌DH5？琢感受态细胞100 μL，加入连接产物5 μL并混匀，置冰上10 min后，42 ℃水浴热激90 s，随即冰浴2 min；加入500 μL LB培养基，恒温摇床振荡培养30 min使其复苏；复苏后的菌液10 000 r/min离心2 min，弃去500 μL上清液，用剩余的100 μL重悬菌体，涂布于含有25 μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上；37 ℃倒置培养12～16 h，直至长出单菌落；挑取平板上长出的单菌落，接种到含卡那霉素的LB培养基中，恒温摇床振荡培养约8 h。取培养后的菌液，用质粒小提试剂盒提取重组表达质粒，进行双酶切鉴定。酶切鉴定的反应体系：10×K Buffer 2.0 μL，NheⅠ 1.0 μL，EcoRⅠ 1.0 μL，重组表达质粒12.0 μL，加ddH2O至20.0 μL。37 ℃酶切4 h后，用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
1.3.4 细胞培养与重组表达质粒的转染 将生长状态良好的HEK293细胞用胰酶消化，稀释到1×105个/mL，接种于24孔细胞培养板，每孔2 mL。置37 ℃恒温培养箱（含5%的CO2）中培养18～24 h至80%细胞汇合。转染前弃去培养液，用OPTI-MEM洗涤一次。按转染试剂Lipofectamin 2000说明书中的步骤，将重组表达质粒、Lipofectamin 2000试剂分别用OPTI-MEM稀释，然后混合，转染HEK293细胞。转染6 h后，更换含10%胎牛血清的DMEM培养基（不含双抗），置37 ℃恒温培养箱中继续培养24 h。
1.3.5 转染细胞中目的基因mRNA的检测 离心收集转染后的细胞，用RNA提取试剂盒抽提细胞总RNA。用DU640型核酸/蛋白测定仪测定核酸浓度，稀释RNA浓度至100 μg/mL。用一步法RT-PCR试剂检测目的基因mRNA，反应体系：2×One step Mix 12.5 μL，one step Enzyme Mix 1.25 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L） 1 μL，RNA模板1 μL，ddH2O补足至25 μL。反应条件：50 ℃反转录30 min；94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸7 min。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳并照像。PCR检测所用引物及扩增片段见表1。
1.3.6 表达蛋白的镜检和Western-blot鉴定 转染24 h后，将细胞培养板置于倒置荧光显微镜下，观察细胞是否有绿色荧光。收集转染后的细胞和培养液，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），并转移至硝酸纤维素膜上；封闭液封闭1 h后，与1∶1 000稀释的抗flag标签单抗37 ℃温育1 h；TBST室温洗膜3次后，与1∶1 000稀释的羊抗鼠IgG（HRP标记）37 ℃孵育45 min；洗膜4次后，加入底物液显色；用滤纸吸去多余的底物液，覆上保鲜膜，X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影、照相。试验中设置转染pDoubleEx-EGFP-flag-N-PBD1质粒的细胞作为阳性对照，设置β-actin抗体组作为内参。
2 结果与分析
2.1 重组表达质粒的构建
通过限制性内切酶酶切并回收人工合成优化后的鸭防御素基因片段，将其插入到pDoubleEx-EGFP-flag-N质粒中构建重组表达质粒。将重组质粒分别用NheⅠ和EcoRⅠ进行酶切鉴定，均可得到约6 400 bp和800 bp两条DNA片段，片段均与预期片段大小相符（图1），表明基因片段已插入到真核表达质粒中。
2.2 鸭防御素mRNA检测
一步法RT-PCR结果表明，以转染重组质粒的细胞总RNA为模板，能扩增出大小约200 bp的特异性片段，未转染的细胞不能扩增到特异性片段（图2），表明插入的鸭防御素基因在细胞中得到转录。
2.3 转染细胞的镜检
转染重组质粒36 h后，转染组细胞长势良好，基本铺满孔底。在荧光显微镜下，转染细胞发出绿色荧光（图3）。未转染组细胞在荧光显微镜下无荧光。表明重组质粒被成功转入HEK293细胞，报告基因EGFP（增强型绿荧光蛋白）已表达。
2.4 重组蛋白的Western-blot鉴定
转染重组表达质粒的293细胞经Western-blot鉴定，结果表明，3种鸭AvBDs重组质粒转染细胞均无明显的表达带，PBD1表达带和β-actin表达带明显，结果见图4，这表明3种鸭防御素未能在293细胞中表达或其表达量极低。
3 讨论
禽类防御素是禽类天然免疫系统的一部分，在抵御病原微生物的侵袭中发挥着重要作用[3]。研究表明，禽类防御素对大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌和某些病毒具有抑制作用[4]。人们对禽类防御素的分子结构、生物学特性、抗微生物机理和应用正进行着越来越深入的研究。由于禽类防御素天然产量低，从机体中提取天然产物的过程复杂且产量低，这使得从人工表达及转基因植物表达等方面对禽类防御素进行研究成为重点。目前，已报道有鸡防御素[5]、鸭防御素[6]、鹅防御素[7]、鹌鹑防御素[8]等禽类防御素获得了表达。然而，这些研究多是利用大肠杆菌或酵母菌等为表达系统。关于禽类防御素在动物细胞中的表达很少报道。动物细胞是否适合表达禽类防御素还有待研究。2010年，侯淑倩[9]报道了鸡β-防御素-5在COS7细胞中的表达，但仅从mRNA水平检测了防御素的表达情况；2011年，单艳菊等[10]利用Flp-In-293细胞表达鸡β-防御素-1，也未从蛋白质水平对表达蛋白进行验证。本研究构建了表达鸭防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12的真核表达载体，并在动物细胞HEK293中对这3种防御素进行了表达。通过检测这3种防御素的mRNA，证实外源防御素基因成功转录，然而用Western-blot并没有检测到相应的蛋白质。这可能暗示用动物细胞大量表达禽类防御素存在一些尚待解决的技术问题。
本研究中的禽类防御素未能大量表达的原因可能有3方面：①禽类防御素分子为碱性小肽，易被蛋白酶降解[11]。目前，大部分研究采用融合表达或串联表达的方法来表达防御素。这些表达方法可以人为增大表达蛋白的分子质量，并使其更容易形成包涵体，从而达到保护表达蛋白不被蛋白酶降解的目的。本研究为了保证防御素分子的高仿真性，只在目的蛋白的末端融合了flag标签（共8个氨基酸），对分子量的改变较小。②外源基因在转录后可能发生基因沉默[12]，这是外源基因在表达过程中时常发生的现象。由于本研究中检测到了3种禽类防御素的mRNA，但未检出目的蛋白，因此推测可能发生了转录后基因沉默。宿主细胞中的一些RNA分子，比如细胞自身转录的某些防御素mRNA，可能对鸭防御素的mRNA造成了干扰，导致无法正常翻译。③外源的禽類防御素可能对宿主细胞HEK293产生毒性作用，导致无法正常表达。已证实防御素对某些动物细胞具有一定的毒性作用，例如人β-防御素2对口腔癌KB细胞具有抑制作用[13]。
本研究构建了3种鸭防御素的真核表达载体，将其转染HEK293细胞行表达，并从RNA水平和蛋白质水平对目的基因的表达情况进行了检测。虽然表达未能成功，但为今后禽类防御素的表达研究提供了参考。
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