[摘要] 为研究芍药苷脂质液晶纳米粒（PaeLLCN）在大鼠不同肠段的吸收动力学特征，并与芍药苷（Pae）溶液进行比较，该试验采用离体肠外翻模型进行肠吸收试验，高效液相色谱法测定Pae的含量，研究PaeLLCN在大鼠十二指肠、空肠、回肠、结肠的吸收状况，并考察不同质量浓度对肠吸收的影响。结果显示，PaeLLCN与Pae在不同浓度不同肠段均有吸收，且各肠段的吸收速率常数Ka随着药物浓度的增加而增加，具有明显的浓度依赖性，提示其可能为被动吸收；PaeLLCN各肠段的累积吸收量Q和吸收速率常数Ka均高于Pae（P<0.05）。该研究结果表明，PaeLLCN与Pae在整个大鼠小肠均有吸收，吸收机制可能为被动吸收；LLCN能显著改善Pae的肠吸收。
[关键词] 芍药苷； 脂质液晶纳米粒； 外翻肠囊法； 肠吸收
芍药苷（paeoniflorin，Pae）是中药赤芍的主要活性成分之一，是从毛茛科植物芍药Paeonia albiflora Pall.或者川赤芍P. veitchii Lynch的根中提取纯化而得。药理研究表明，Pae具有抗自由基损伤，抑制细胞内钙超载和抗神经毒性等活性，体内试验证明其有降低血液黏度、抗血小板聚集、扩张血管、改善微循环、抗氧化、抗惊厥等多种生物学效应，并且毒副作用较小[13]。然而，由于肠首过效应、药物转运体外排蛋白及药物理化性质的影响，Pae胃肠吸收差，口服生物利用度低，仅为3%～4%[45]。此外，Pae性质不稳定，在光照及高温条件下均易降解[67]。
为提高Pae的稳定性，改善其口服生物利用度，课题组首次将Pae载入脂质液晶纳米粒[8]。脂质液晶纳米粒（lipid liquid crystalline nanoparticles，LLCN）是指一定浓度的两亲性脂质分散在水溶液中自组装成含双连续水区和脂质区的闭合脂质双层“蜂窝状（海绵状）”结构的纳米粒[910]。与其他剂型相比，LLCN具有制备工艺简单、良好的生物降解性、包封不同极性的药物、提高药物稳定性、促进药物吸收、表明修饰可实现靶向给药等优点[1112]。
本试验采用外翻肠囊法研究芍药苷脂质液晶纳米粒（PaeLLCN）的肠吸收特征，探讨PaeLLCN的吸收机制，并与Pae原料药进行比较，为PaeLLCN深入研究提供试验依据。
1 材料
KQ500DE型超声数控波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Winner801纳米激光粒度仪（济南微纳颗粒仪器股份有限公司）；岛津LC20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；TGL16B高速台式离心（上海之信仪器有限公司）；BAS124S电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；WH861涡旋混合器（北京科尔德科贸有限公司）。
Pae对照品（纯度>96.45%，中国食品药品检定研究院，批号110736201438）；Pae原料药（纯度90%，西安百川生物科技有限公司，批号150113）；单油酸甘油酯（GMO）、泊洛沙姆407（F127）（国药集团化学试剂北京有限公司，批号分别为9003116，9003116）；氢氧化钠、磷酸二氢钠（北京化工厂，批号分别为20130811，20120214）；甲醇、乙腈为色谱纯，水去离子水，其余试剂均为分析纯。
Tyrode液（自配）：每1 000 mL含NaCl 8.0 g，KCl 0.20 g，CaCl2 0.2 g，NaHCO3 1.0 g，MgCl2 0.1 g，NaH2PO4 0.05 g，葡萄糖1.0 g，NaOH调解pH 7.2～7.4[13]。
SD大鼠，雄性，体重（200±20） g，SPF级，由军事医学科学院实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（军）2012004。
2 方法与结果
2.1 PaeLLCN的制备[8]
取芍药苷40 mg，与100 mg GMO共溶于2 mL无水乙醇中，在搅拌条件（500 r·min-1）下，将乙醇溶液缓慢滴加至20 mL含10 mg F127的磷酸盐缓冲液（pH 5.0）溶液中，室温下持续搅拌4 h挥去乙醇，得粗分散液；经间断超声5 min（80 W，10次，每次间隔25 s，间隔期内样品放置0 ℃水浴内）进一步分散，得到PaeLLCN分散液。
2.2 PaeLLCN的粒径分布、包封率及载药量的测定
采用纳米激光粒度仪分析PaeLLCN粒径分布，结果显示PaeLLCN平均粒径为（183±11） nm，多分散度指数为0.191±0.021。采用反透析法测定PaeLLCN的包封率并计算载药量，结果显示PaeLLCN包封率为74.23%，载药量为14.57%。
2.3 肠吸收液中Pae分析方法的建立
2.3.1 色谱条件 AlltimaTMC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈0.1%磷酸溶液（17∶83），流速1.0 mL·min-1；检测波长230 nm；柱温25 ℃；进样量10 μL。
2.3.2 芍药苷对照品溶液的制备 取Pae对照品适量，精密称定，转移至棕色的量瓶中，加甲醇，最后定容制成1 mL含有0.9 mg的Pae对照品储备溶液。
2.3.3 供试品溶液及阴性对照液的制备 精密吸取各时间点肠吸收液样品300 μL于1.5 mL离心管中，加甲醇300 μL，超声5 min，涡旋混匀3 min，8 000 r·min-1离心10 min，取上清液即得供试品溶液。取空白肠吸收液同法制得阴性对照液。
2.3.4 专属性考察 取对照品溶液、阴性对照液与供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图1。阴性对照溶液在与Pae对照品相同保留时间处未见色谱峰，故认为空白肠吸收液对测定无干扰。
2.3.5 线性关系考察 取芍药苷对照品储备液，按不同比例稀释至质量浓度为14.4，7.2，3.6，1.8，0.9 mg·L-1系列对照品溶液，按2.3.1项下色谱条
件进样分析，记录峰面积。以峰面积（Y）对Pae质量浓度（X，mg·L-1）进行线性回归，得回归方程为
Y=26 977X+1 484.5，R2=1，表明Pae在0.9～14.4 mg·L-1线性关系良好。
2.3.6 精密度试验 取2.3.4项下Pae质量浓度为1.8，3.6，7.2 mg·L-1的对照品溶液，按2.3.1项下色谱条件进行HPLC分析，连续测定5次，记录峰面积，计算日内精密度。按上述方法连续测定5 d，计算日间精密度。结果显示低、中、高浓度的Pae日内精密度RSD为0.97%～1.8%，日间精密度RSD为1.5%～2.4%，符合生物样品分析要求。
2.3.7 稳定性试验 取十二指肠于30，60，120 min时的肠吸收液样品，于0，1，2，6，12，24 h分别进样分析，记录峰面积。结果显示峰面积RSD为1.1%～1.9%，表明供试品在24 h内稳定性良好。
2.3.8 回收率试验 取Pae对照品储备液适量，用Tyrode液稀释成高、中、低7.2，3.6，1.8 mg·L-1 3个质量浓度的溶液，每个浓度3份样品，按2.3.3项下方法处理，按2.3.1项下色谱条件进样分析，记录峰面积，计算药物浓度，并与实际值比较，求得平均回收率。结果显示Pae平均回收率为96.53%～103.1%，RSD 2.2%。
2.4 大鼠外翻肠囊法试验[1315]
以Tyrode液为溶剂分别配制含Pae原料药和PaeLLCN质量浓度为30，15，7.5 mg·L-1（以Pae计）的溶液作为肠囊供试液。
大鼠18只，随机分成6组，分别为Pae原料药和PaeLLCN高、中、低6个剂量组。试验前大鼠禁食12 h，自由饮水。10%水合氯醛（3 mL·kg-1）腹腔注射麻醉，沿腹中线解剖，打开腹腔，小心剥离大鼠肠管同肠系膜，取出十二指肠、空肠、回肠、结肠各段约10 cm。用Tyrode液灌流冲洗至无内容物流出，小心剥离肠段表面的肠系膜、血管和脂肪，用Tyrode 液冲洗干净后小心将肠管翻转，使肠黏膜面向外，浆膜层向内。用手术线分别将翻转后的各肠段一端结扎，另一端结扎于自制塑料套管，形成囊状肠管，便于取样。向肠囊内加入2 mL 空白Tyrode 液，并将其移入装有不同质量浓度Pae或PaeLLCN的麦氏浴漕中，试验过程中保持37 ℃恒温，并向浴槽中通入95% O2和5% CO2混合气体。分别于15，30，45，60，90，120，150 min从肠囊内取样0.3 mL，同时补加同温同体积的空白Tyrode液。试验结束后，测量各肠囊的长度和内径。将各时间点样品，按2.3.3项下方法处理，按2.3.1项下色谱条件进行测定，计算肠吸收液药物浓度，并按下式计算药物各时间点单位面积累积吸收量
2.5 PaeLLCN和Pae原料药在不同肠段的吸收比较
2.5.1 PaeLLCN与Pae不同浓度在不同肠段的累积吸收量Q比较 PaeLLCN与Pae在不同肠段均有吸收，且各肠段的累积吸收量Q均呈剂量依赖性增加，PaeLLCN组中Pae的Q显著高于相同质量浓度的Pae组（P<0.05）。与十二指肠段相比，PaeLLCN组中空肠段Pae的吸收显升高（P<0.05），回肠和结肠在低剂量和中剂量组略有升高，在低剂量组略有下降，但均无显著性差异，见图2。
2.5.2 PaeLLCN与Pae的吸收速率常数Ka比较 以各时间点单位肠管面积累积吸收量（Q）对时间（t）绘制吸收曲线，求得吸收速率常数Ka，结果见表1。PaeLLCN与Pae 的Ka均随给药剂量的增加而增加，说明Pae为被动吸收。除十二指肠与结肠低剂量组外，PaeLLCN组的Ka均高于同剂量Pae组（P<0.05）。
2.6 数据统计
所得数据以±s表示，采用SPSS 19.0软件进行统计分析，组间比较用重复测量的单因素方差分析和t检验，P<0.05表示其差异有统计学意义。
3 讨论
外翻肠囊法是目前较为广泛的研究药物肠吸收的方法，与其他小肠吸收模型相比，具有操作简单、快捷、廉价、重复性好等优点。该方法保持了组织和黏膜的完整特性，可在体外模拟体内生理状态下不同肠段对药物的吸收情况，其在中药吸收成分群的发现、药物吸收相互作用、药物吸收部位及吸收机制的研究等方面广泛应用[1617]。但由于影响药物吸收因素很多，试验结果与实际体内吸收存在一定差异，其研究结果需进一步的体内试验证明。
本试验采用外翻肠囊法对PaeLLCN的肠吸收进行考察，结果显示，PaeLLCN与Pae在各肠段均有吸收，且累积吸收量Q与吸收速率常数Ka均呈剂量依赖性增加，说明其为被动吸收；PaeLLCN的累积吸收量Q与吸收速率常数Ka均显著高于同剂量Pae组（P<0.05），表明LLCN能够提高Pae在大鼠小肠的吸收，分析其可能原因如下：①Pae水溶性好，但其亲脂性较弱，在肠壁上很难透过细胞膜的磷脂双分子层，PaeLLCN脂溶性增加从而提高吸收；②LLCN具有较高生物黏着性[18]，可以粘附在胃肠壁上，延长药物的作用时间从而改善吸收。本研究结果表明将Pae制成LLCN后能增加其在小肠的吸收，提示对提高其生物利用度具有良好的应用潜能。
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[责任编辑 曹阳阳]