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摘 要 植物在发育过程中会面临多种病原菌的侵染，在长期的进化中，植物演化出了两道免疫防线来抑制病原菌的破坏。第一道防线是病原相关分子模式所触发的免疫反应（PAMP-Triggered Immunity，PTI），第二道防线是效应因子触发的免疫反应（Effector-Triggered-Immunity，ETI）。在ETI过程中，植物抗病基因编码的抗病蛋白具有保守的核苷酸结合位点（nucleotide binding site，NBS）以及富含亮氨酸重复序列（Leucine rich repeat ，LRR），它能够直接或者间接的识别病原菌释放的效应因子，引起效应因子触发的免疫反应，引起植物细胞的主动死亡，即超敏反应（Hypersensitive response，HR），进而抑制病原菌的侵染。通过基因组分析，拟南芥中大约有125个植物抗病基因，但是只有RPM1 与RPS2等少数抗病基因的功能得到报道，并且对于植物抗病信号途径的研究也不是很清楚。这是因为传统的遗传学分析方法去研究植物抗病基因的功能存在局限性，造成这种局限性的主要原因是因为植物抗病基因的功能冗余以及参与植物抗病信号转导通过的上下游基因缺失致死。笔者综述了近年来关于植物抗病机制的研究进展，并介绍了该领域主要存在的问题。
关键词 抗病机制 抗病蛋白 超敏反应
中图分类号：S432.2 文献标识码：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdkz.2016.09.064
Research Progress on the Mechanism of Plant Disease Resistance
YANG Yin， GAO Zhiyong
（Key Laboratory of Hybrid Rice， School of Life Science， Wuhan University， Wuhan， Hubei 430072）
Abstract Plants in the development process will be faced with a variety of pathogen infection， in the long term evolution， the plant evolution of the two line of defense to inhibit the destruction of pathogenic bacteria. The first line of defense is the immune response （Immunity PAMP-Triggered， PTI） triggered by pathogen associated molecular patterns， and the second line of defense is the immune response （Effector-Triggered-Immunity， ETI） triggered by effector factors. In the ETI， plant disease resistance genes encoding resistance proteins with conserved nucleotide binding site （nucleotide binding site， NBS） and leucine rich repeats （leucine rich repeat LRR）， it can directly or indirectly to the identification of pathogenic bacteria release effect factor and effector triggered immunity induced by plant cell active death， namely hypersensitive response （Hypersensitive response HR）， thereby inhibiting pathogenic bacteria infection. Through genomic analysis， there are about 125 plant disease resistance genes in Arabidopsis， but only RPM1 and rps2 and a few other resistance gene function get reported， and the study of plant disease resistance signaling pathways is not very clear. This is because of the traditional genetics analysis method to study plant disease resistance genes of functional limitations， causing the main reason for this limitation is killed because of plant disease resistance genes are functionally redundant and involved in plant disease resistance signal transduction through the upstream and downstream gene deletion. The research progress of plant disease resistance mechanism in recent years is reviewed， and the main problems in this field are also introduced.
Key words resistance mechanism； resistant protein； hypersensitivity
植物在生长发育过程中会面临各种逆境，包括干旱、高温、低温、重金属、病毒、细菌等各种致病菌，在严重时，会导致植物的死亡，严重影响农作物的产量。为了抵抗致病菌的毒害作用，植物体演化出了一套完善的免疫系统，来抵抗病源微生物的感染，增加了植物的存活率。
植物和动物最大的区别在于植物的整个生活周期中，植物大多数都被固着在同一个自然环境，不能够主动避开害虫、病原菌的侵害，只能够被动接受各种害虫以及病原菌的侵染，但植物却进化出了两道防线来抵抗病原菌以及害虫的破坏。第一道防线是病原相关分子模式所触发的免疫反应（PAMP-Triggered Immunity，PTI），这个过程是由植物细胞膜表面的模式识别受体PRR识别病原菌的病原体相关的分子模式PAMP介导的免疫过程；第二道防线是效应因子触发的免疫反应（Effector-Triggered-Immunity，ETI），这个过程是由植物抗病基因编码的抗病蛋白识别病原菌分泌的效应因子所介导的免疫过程。在ETI过程中，植物体发生能够超敏反应（Hypersensitive Response，HR），即植物细胞的主动性死亡过程，能抑制病原菌的增殖。
目前，植物的天然免疫系统被分为四个阶段，第一个阶段是由PRR识别PAMP介导的PTI，能够抑制病原菌的生长；第二个阶段是部分病原菌释放致病效应因子，干扰PTI，引起效应因子触发的敏感性，进而促进病原菌的增殖；第三个阶段是植物抗病基因编码的抗病蛋白直接或间接地识别特异的效应因子，引发ETI，往往会在病原菌的侵染位点引起超敏反应（Hypersensitive response，HR）进而再次抑制病原菌的生长；最后一个阶段是部分效应因子通过自然选择的进化机制，避免被植物抗病蛋白的识别，进而抑制ETI，再次促进植物病原菌的生长。①
1 病原相关分子模式所触发的免疫反应
第一道防线是当病原菌接触植物表层的时候，由保守的PAMP激发，它们被模式识别受体PRR所识别，因此，这一层次的免疫被叫做病原相关分子模式所触发的免疫反应（PAMP-Triggered Immunity，PTI）。大部分病原菌都具有保守的分子特征，即PAMP，包括真菌的几丁质、细菌的鞭毛蛋白、肽聚糖、脂多糖等，PRR识别并结合这些保守的PAMP后，会被激活，激活后的PRR结合BAK1，并相互磷酸化，形成有活性的复合体，最终磷酸化得PRR-BAK1复合体激活下游的MAPK或CDPK，引起PTI，抑制病原菌的增殖，起到免疫的作用（图1）。②
2 效应因子触发的免疫反应
当病原菌侵染植物表面时，会被PRR识别，引起第一层防御应答PTI，但部分病原菌能通过III型分泌系统向宿主植物细胞分泌多种效应因子，③修饰植物抗病途径的某个蛋白质，抑制或者减弱植物的防御机制，从而促进病原菌的增殖，最终引起植物发病。此时，植物抗病基因编码的植物抗病蛋白能够直接或者间接地去识别并结合效应因子，引起细胞内信号转导，在病原菌的侵染位点会发生HR，起到抑制病原菌侵染的作用。比如flg22是细菌的鞭毛蛋白成分，在侵染植物时，会被FLS2识别，进而引起PTI免疫应答，但实验表明病原菌至少产生了3种TTSS效应因子（AvrPto，AvrPtoB和AvrPphB），通过抑制FLS2对flg22的识别，并促进病原菌的增殖。
植物抗病蛋白直接识别效应因子的显著例子是水稻中抗病蛋白Pita，能够直接结合稻瘟菌分泌的效应因子AvrPita，抑制其功能，起到免疫的作用（图2a）。大多数情况下，植物抗病蛋白都是通过间接方式，去识别效应因子。最明显的例子就是拟南芥中的植物抗病蛋白RPM1，病原菌分泌的效应因子AvrRpm1和AvrB将RIN4蛋白磷酸化，然后RPM1才能识别磷酸化的RIN4，最终引起HR，起到免疫的作用（图2b）。
图2 ETI：效应因子触发的免疫反应
3 植物抗病蛋白
在高等植物免疫系统的长期演化中，进化出了ETI天然免疫过程，而这种过程就是由植物抗病基因（Disease resistance gene，R gene）编码的抗病蛋白介导的。当抗病蛋白被相应的效应因子激活后，引起类似于动物细胞程序性死亡的超敏反应，进而抑制病原菌的生长；如果效应因子没能被抗病蛋白识别，就能抑制植物体的免疫应答，致使植物发病。
玉米抗圆斑病基因（Hm1）是人们克隆的第一个植物抗病基因。截止到目前为止，人们主要是从拟南芥中克隆到大量的植物抗病基因，比如RPM1，RPS2等。大多数抗病基因编码的植物抗病蛋白具有保守的结构域，分别是核苷酸结合位点以及富含亮氨酸重复序列，有的抗病蛋白还含有丝氨酸/苏氨酸激酶结构域等。④NBS结构域是抗病蛋白的保守结构，通常被称为NB-ARC结构域（Nucleotide-Binding adaptor shared by Apaf-1， Resistance proteins and CED-4），可能参与结合并水解核苷酸，调控抗病蛋白的活性，并且Apaf-1和CED-4参与了哺乳动物的细胞程序性死亡途径，与抗病蛋白引起的超敏反应非常相似，暗示了动植物可能具有共同的祖先；⑤LRR结构域结构相对多样，参与了与病原菌的协同进化，能够帮助抗病蛋白识别病原菌，研究证明LRR参与了病原菌的识别和信号转导。因此根据抗病蛋白的保守性结构，将其分为四大类。
在拟南芥基因组中大约有125个植物抗病基因，这些抗病基因编码的抗病蛋白能够特异识别病原菌分泌的效应因子，引起ETI。RPM1是一种功能得到报道的典型的抗病蛋白，具有NBS和LRR结构域，能够识别两种Ⅲ型效应因子，AvrRpm1和AvrB。⑥研究表明，AvrRpm1和AvrB被释放到植物中是被定位在细胞膜上，使RIN4蛋白磷酸化，进而激活RPM1蛋白的功能，也就是只有RIN4磷酸化后才能激活RPM1，但同时人们发现RPM1的突变体RPM1（D505V）也能模拟磷酸化的过程，即使不存在RIN4的时候也能发生自激活过程，引起超敏反应。
4 超敏反应
在病原菌侵染植物时，植物细胞会在病原菌侵染位点主动的发生细胞死亡，形成枯斑，从而抑制病原菌生长，这种为了抑制病原菌而引起的主动死亡的现象叫做超敏反应（Hypersensitive Response，HR），这是一种主动的有益的死亡现象，类似于动物发育过程中的程序性细胞死亡，因此目前HR是指为了抑制病原菌生长而主动引起的一种植物细胞死亡现象。
HR发生后，在病原菌感染部位的植物叶片逐渐变为褐色，最终死亡，它对植物的抗病反应有极其重要的作用，因为病原菌感染部位快速的植物细胞死亡可以有效的抑制病原菌获取营养物质，明显的抑制病原菌的增殖。在这个过程中，虽然会导致植物体部分叶片的枯萎死亡，但是局部组织的死亡不仅能够形成一条天然的防线，抑制病原菌的继续生长，而且死亡的植物细胞能够积累酚醛树脂，同时释放植物抗毒素，同样也会抑制病原菌的增殖，从而抑制病原菌对植物体的侵染，从而最终起到抵抗病原菌的目的。除此之外，HR还可以诱发周围的组织的特异性防御反应，最终使得植物获得系统抗性。
HR的发生过程涉及到两个主要步骤：（1）侵染植物的病原菌和植物体通过Avr蛋白与R蛋白之间的直接或间接作用而被识别；（2）信号分子的传导，最后引起植物体发生HR。当病原菌被识别后，产生活性氧中间体，同时引起离子流快速穿过细胞质膜。⑦有研究表明，H2O2能够诱导植物细胞死亡，而超氧游离基则是ROI触发细胞死亡的关键成分；而超氧化物能够扩散并被歧化生成H2O2或者是其他的有毒的ROI，进而破坏细胞质膜。
活性氧中间体的产生以及XR的发生激活了植物体的防御反应，包括激活抗病蛋白以及HR导致的主动的细胞死亡，同时，保护机制也会被诱导发生，控制细胞死亡的程（下转第186页）（上接第139页）度。除此之外，NO、茉莉酸、乙烯等都是HR相关的信号分子，并且，线粒体、液泡和蛋白酶等也参与了HR反应的信号传导及其调控。
5 遗传学方法分析植物抗病基因的局限性
通过基因组分析，在拟南芥中一共有125个编码核苷酸结合位点（Nucleotide binding site，NBS）和富含亮氨酸重复序列（Leucine Rich Repeat ，LRR）的基因，但是目前仅有RPM1以及RPS2等少数几个植物抗病基因的功能以及相关的信号途径得到了报道，但是对于抗病的具体分子机制不清楚，这意味着绝大多数的植物抗病基因的功能仍然需要进一步的研究。
研究这些基因功能的常用方法是通过突变体筛选，但是在研究植物抗病信号途径的时候，这种传统方法研究植物抗病基因的功能存在很大的局限性。首先植物基因敲除的周期长，工作量大；其次，对于参与植物抗病信号途径的其它基因的缺失具有致死作用，所以没办法拿到植物的突变体，更不用说去研究这个基因的功能；最后，植物抗病基因可能存在大量的功能冗余。
RPM1基因是典型的植物抗病基因，能够识别被效应因子AvrRpm1和AvrB磷酸化的RIN4蛋白，引起HR，但是对于其具体的信号转导途径仍然了解不多，对于参与RPM1介导的信号转到途径的上下游蛋白了解很少。有人通过传统的遗传学分析方法，期望筛选无法识别效应因子AvrRpm1和AvrB并引起HR的rpm1突变体，进而鉴定参与RPM1介导的信号转到途径的上下游蛋白，最后一共筛选到110个突变体，但其中95个突变体株系都是RPM1基因本身的突变，⑧所以这种筛选突变体分析基因功能的方法对于其他的基因也行可行性较高，但是对与植物抗病基因及其相关的信号转导途径的研究，却存在很大的局限性。
6 讨论
植物的天然免疫系统由PTI和ETI构成，这对植物的正常生长是必须的。PTI是有PRR蛋白介导，而ETI则是由植物抗病基因编码的抗病蛋白介导，结果会导致超敏反应的发生，但是对于超敏反应和植物抗病之间的关系，目前争论较多，对于两者的因果关系仍然存在争论，而且超敏反应是否是植物抗病所必须，这个有待进一步去研究。
目前，拟南芥中有125个抗病基因，但大多数抗病基因的功能都未得到报道，且相关的信号转导途径也了解较少，主要的原因是引物抗病基因的冗余及上下游基因的确实致死，所以现在人们尝试用新的方法去解决这个问题。本实验室尝试用大肠杆菌和酵母去分析植物抗病基因的功能，取得了一定的进展，初步证明了这种方法的可行性。
虽然，目前对植物抗病领域的研究仍然存在很多问题，但是随着基因组测序技术、基因敲除技术、电子显微技术以及其他各种技术手段的成熟，在不远的将来，对植物抗病的分子机制的研究一定会取得重大进展，这对提高农作物产量，解决粮食危机，具有重大的意义。
*通讯作者：高志勇
注释
① Jones JDG， Dangl JL： The plant immune system. Nature 2006， 444（7117）：323-329.
② Dodds PN， Rathjen JP： Plant immunity： towards an integrated view of plant-pathogen interactions. Nature reviews Genetics ，2010.11（8）：539-548.
③ Grant SR， Fisher EJ， Chang JH， Mole BM， Dangl JL： Subterfuge and Manipulation： Type III Effector Proteins of Phytopathogenic Bacteria. Annual Review of Microbiology 2006.60：425-449.
④ Staskawicz BJ， Ausubel FM， Baker BJ， Ellis JG， Jones JD： Molecular genetics of plant disease resistance. Science 1995， 268（5211）：661-667.
⑤ Liu P， Danot O， Richet E： A dual role for the inducer in signalling by MalT， a signal transduction ATPase with numerous domains （STAND）. Molecular microbiology 2013.90（6）：1309-1323.
⑥ Dangl JL， Ritter C， .， Gibbon MJ， Mur LA， Wood JR， Goss S， .， Mansfield J， .， Taylor JD， Vivian A， . Functional homologs of the Arabidopsis RPM1 disease resistance gene in bean and pea. The Plant cell 1992.4（11）：1359-1369.
⑦ Baker CJ， Orlandi EW， Mock NM： Harpin， An Elicitor of the Hypersensitive Response in Tobacco Caused by Erwinia amylovora， Elicits Active Oxygen Production in Suspension Cells. Plant Physiol 1993.102（4）：1341-1344.
⑧ Tornero P： Large-Scale Structure -Function Analysis of the Arabidopsis RPM1 Disease Resistance Protein. The Plant Cell Online 2002.14（2）：435-450.