摘要：实地调查四川5市（县）猕猴桃（Actinidia chinensis）发病情况，从发病果园采集染病枝条并分离病原菌，进行致病性测定，以细菌常规鉴定及基于16S rDNA序列的分子生物学鉴定等确定病原菌。病害调查显示染病猕猴桃枝干上形成渗出白色或红褐色黏液的溃疡；叶片上常形成带黄晕的不规则暗褐色病斑，且名山和苍溪两地的发病情况比起其他三地更为严重。从病枝中分离到5株优势菌株，经鉴定为丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种（Pseudmonas syringae pv. actinidiae）。病害调查中观察到的症状与细菌性溃疡病症状相似，分离得到的病原菌与国内其他地区的报道一致。
关键词：猕猴桃；溃疡病；丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种；病原菌；四川
中图分类号：S436.634 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）20-4937-05
Occurrence and Pathogen Identification of Kiwifruit Bacterial Canker in Sichuan
LIU Yao1，ZHU Tian-hui1，FAN Fang-bing1，SHAO Bao-lin1，2
（1. College of Forestry， Sichuan Agricultural University， Ya’an 625014， Sichuna，China；
2. Sichuan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Chengdu 610041， China）
Abstract： By investigating the occurrence of kiwifruit bacterial canker in five cities and counties in Sichuan province， pathogenic bacteria was isolated from infected trunks of kiwifruits collected from kiwifruit orchard and identified with the pathogenicity test， bacteriological study and molecular identification based on the 16S rDNA sequences. Disease survey showed that the irregular dark brown spots surrounded with yellow halos were often formed on the infected kiwifruit leaves cankers with white or reddish-brown exudates were shaped on the infected trunks， leaders and twigs. The occurrence of disease in Cangxi and Mingshan was more serious than those in the other three places. Furthermore， five isolates of the pathogenic bacteria were obtained and identified as Pseudmonas syringae pv. actinidiae. The symptoms observed in the investigation were similar to the symptoms of bacterial canker and the isolates were also consistent with previous reports in other regions of China.
Key words： Kiwifruit； bacterial canker disease； Pseudomonas syringae pv. actinidiae； pathogen； Sichuan
猕猴桃溃疡病是一种具有毁灭性的细菌性病害，于20世纪80年代早期在日本和美国被发现并作了较为详细的报道[1，2]。随后，此病相继在韩国、伊朗、意大利等国出现[3-5]。在中国，该病最早发现于湖南[6]，之后便迅速蔓延至四川、安徽、福建等省[7-9]。该病害主要危害猕猴桃（Actinidia chinensis）的新梢、侧枝、主干及叶片，造成枝蔓枯死，严重时甚至整株枯死，不仅降低猕猴桃产量，而且导致果皮厚、果酸、果色差，果实品质降低，果树树势变差，严重制约猕猴桃种植。该病于1996年被列为国内森林植物病害检疫对象[10]。近年来，四川多地大力发展猕猴桃产业，建立起规模较大的种植园区，但是猕猴桃溃疡病的发生一直伴随着整个产业的发展。为了更好地在四川地区检疫和防治该病，本研究在实地病害调查基础上，采集5地染病枝条，分离鉴定引起该病的病原菌，以期为后续防治工作提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 病害调查与病枝采集
实地逐株调查四川省都江堰市、苍溪县、崇州市、德阳市以及名山县主要猕猴桃栽培区病害发生情况，记录发病症状、发病率、调查时间和地点等，并从发病果园采集染病的枝条。
1.2 病原菌分离
病原菌分离的培养基采用牛肉膏蛋白胨（BPA）培养基（牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，蔗糖10 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.0）。
将各地采集到的发病枝条洗净后，于新鲜病健交界处切取4 mm×4 mm的小块带病斑的组织，用无菌水冲洗3次后分别用75%的乙醇和0.5%～1.0%的次氯酸钠进行表面消毒，病组织在消毒液中浸泡1～2 min，再用无菌水冲洗3次后移至装有无菌水的培养皿中，制成菌悬液涂布BPA培养基，25 ℃培养1～2 d后挑取单菌落在BPA培养基上多次划线纯化，将纯化后的分离菌株转至BPA斜面培养基上4 ℃保存。
1.3 标准菌株和对照菌株
标准菌株为丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae），对照菌株为丁香假单胞杆菌丁香致病变种（Pseudomonas syringae pv. syringae），二者均由中国林业科学院森林生态环境与保护研究所提供。标准菌株主要用于生理生化指标测定时与待测菌株进行对比；对照菌株主要用于寄主致病性测定时与待鉴定菌株进行对比。
1.4 致病性测定
1.4.1 烟草过敏性反应测定 将从猕猴桃病枝上分离到的5株测试菌株在BPA培养基上28 ℃培养48 h，用无菌水配制成1×109 CFU/mL的菌液，用6号医用一次性注射器吸取菌液，对5～6叶龄的烟草叶片进行下表皮皮下渗入，每个菌株接3株共9片叶，以无菌水为对照，25 ℃下保湿培养24 h后观察其过敏性反应。
1.4.2 对猕猴桃的致病性测定 将采自四川省雅安市多营镇的猕猴桃离体带叶枝条插于清水中，接种时先用70%乙醇对枝条表面消毒，然后用I号昆虫针5根捆成一束蘸取在BPA培养基上28 ℃培养2 d的细菌悬液针刺接种，每个菌株分别接3根枝条，每根枝条接2个位置，以无菌水和丁香假单胞杆菌丁香致病变种作为对照。接种后套袋15 ℃保湿培养，逐日观察发病情况。待发病后，从发病组织进行病菌再分离，以完成柯赫氏法则的要求，获得的纯培养分离菌株用于细菌学性状测定。
1.5 细菌学性状测定
1.5.1 病原菌形态特征和染色反应 细菌的形态观察采用透射电镜技术。将供试菌株用无菌水配制成浓度为1×107 CFU/mL的菌液，滴1滴于铜网上，室温下吸附5 min，滤纸吸干，再加11%磷钨酸负染1～2 min，吸去多余液体，待干后于日立H-600型透射电镜下观察菌体形态、鞭毛数目和着生位置。同时按常规进行革兰氏染色、荚膜染色和芽孢染色，置于光学星微镜下观察。
1.5.2 培养性状观察 供试菌株在BPA培养基上28 ℃培养2 d后观察菌落的性状特点。
果聚糖产生试验：配制含蔗糖培养基（蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，蔗糖 50 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.0～7.2）和含葡萄糖培养基（蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖 50 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.0～7.2）。分别在两种培养基上划线培养，观察菌落形态。
KBA产荧光试验：供试菌株在KBA培养基（甘油 10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，K2HPO4 1.5 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，琼脂 20 g/L，pH 7.2）上培养3 d后在紫外灯下观察。
1.5.3 病原菌生理生化测定 主要生理生化测定参照文献[11]、[12]等进行，以无菌水和标准菌株作对照。
1.6 基于16S rDNA序列的分子鉴定
1.6.1 供试菌株基因组DNA提取 挑取纯化后的单菌落移植至LB液体培养基（胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L），25 ℃下250 r/min摇床培养过夜。然后使用天根生化科技有限公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒提取各参试菌株的基因组DNA。
1.6.2 供试菌株16S rDNA序列的PCR扩增 根据已发表的植物病原细菌16S rDNA通用引物[13]（27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′；1492r：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）对各供试菌株进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为50 μL，含25 μL Premix Taq（日本宝生物工程有限公司），2 μL引物27f，2 μL引物1492r，5 μL DNA模板，ddH2O补足总体积。反应混合液在95 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。反应结束后取5 μL PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，检测后将PCR产物送至上海生工生物工程有限公司测序。
1.6.3 序列比对及系统发育树构建 将获得的测序结果在GenBank数据库中进行BLAST同源序列比对，从中选取相似序列，使用MEGA 4.0和Clustral X软件完成序列匹配，采用邻接法进行聚类分析，构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 调查地病害发生情况及比较
2011年3月中下旬至4月下旬进行实地症状观察，图1、图2分别显示的是名山县和苍溪县病株溃疡病的发病症状。病株的分枝处表现出典型的溃疡病腐烂症状，发病部位裂缝及其附近区域颜色均转为赤褐色，从裂缝及邻近病斑的皮孔处分泌出大量菌渗物，菌渗物为淡褐色胶状黏性液体，流胶处的树皮也变成黑色。细心观察，可以发现病部周围还存在白色小粒状菌露。
标本观察。图3、图4和图5分别为采自崇州市、德阳市和都江堰市的病株标本，这些病株的病部出现许多赤锈色的小点，其皮层组织也呈赤褐色。剥开树皮，可见到褐色坏死的导管组织及其邻近的变色区，皮层被侵染后皱缩干枯；病株上形成1 mm×3 mm左右的裂缝，周围渐转为愈伤组织。
叶片发病后（图6）先形成红色小点，外围可见不明显的黄色晕圈，后形成2～3 mm不规则的褐色到暗褐色病斑，可见宽约2～5 mm的明显黄晕，潮湿条件下扩大成多角形水渍状大斑。
经统计，5个调查地中苍溪、名山两地发病严重，发病率达30%～40%，而其他3地发病相对较轻，发病率为15%左右。究其原因可能是由于苍溪县相对于崇州市、德阳市和都江堰市3个四川中部城市处在偏东北的山地，山地相对于中部盆地更为冷湿，冬寒夏凉，年均温低于中部地区；名山县地处四川偏西南地区，也处在山地，且常年多雨，年均温同样低于这3地，而猕猴桃溃疡病最易在阴冷潮湿的环境中发生。因此推测气候、地理原因可能是造成两地区发病更为严重的主要原因。
2.2 猕猴桃溃疡病病原菌分离
从采集的病株样本中共分离得到12株疑似病原菌菌株，选取其中典型的5株作为供试菌株，将其编号为DY10、CX9、DJY33、CZ8、MS16。
2.3 致病性测定
2.3.1 烟草过敏反应 烟草过敏反应测定结果（图7）显示，烟草叶片接种供试菌株24 h后，全部出现枯斑，证明有过敏反应。初步表明供试菌株具有致病性。
2.3.2 对猕猴桃的致病性测定 对猕猴桃的致病性测定结果（图8）表明，供试菌株接种到猕猴桃枝干上9～16 d后，接种处出现明显的染病症状，其具体特征是在枝干接种处病变，流出黄色汁液，随后颜色由浅变深，最后变成深红和锈红色，这是菌溢体氧化的结果。感病部位韧皮部细胞坏死，组织褐变，芽体不发，枝条枯干。分离病组织，然后重新回接到猕猴桃枝条上，其表现出相同的症状。对照株接种点未见发病。
2.4 细菌学性状
2.4.1 细菌形态特征和染色反应 透射电镜和革兰氏染色反应的镜检（图9）表明，菌体为短杆状，少数稍弯曲，大小为1.46～2.30 μm×0.35～0.50 μm，多数1根鞭毛，极生，少数为2～3根。病原菌革兰氏染色为阴性，不具荚膜，不产生芽孢。
2.4.2 培养性状的观察 在BPA培养基上，菌落圆形，略微隆起，乳白色，边缘全缘，表面光滑，半透明；菌落生长速度较慢，培养24 h菌落仅有针尖大，培养36 h菌落直径为0.75～2.02 mm；在KBA培养基上不产生荧光；在蔗糖培养基上菌落为黏液状，表明有果聚糖产生。
2.4.3 病原菌生理生化反应 病原菌生理生化反应试验结果见表1。5株供试菌株的氧化酶试验、精氨酸双水解酶试验和马铃薯软腐试验结果均显示为阴性，无冰核活性，产氨，耐盐力为3%～4%，不液化明胶，不能使硝酸盐还原，石蕊牛乳反应呈弱碱性，能利用相同的糖类和氨基酸。所有生理生化指标测试结果均与标准菌株一致。
2.5 基于16S rDNA序列的分子鉴定
按照1.6.1的方法提取各供试菌株的基因组DNA，电泳检测提取的DNA样品，条带高亮清晰无拖尾现象，表明DNA质量较高，可直接用于PCR反应。用16S rDNA通用引物扩增参试菌株DNA，得到大小约为1 500 bp的清晰条带，符合预期大小，扩增特异性较高。通过对测序结果进行BLAST同源比对，结果显示供试的5个菌株的16S rDNA序列与NCBI网站上的PSA菌株（GenBank AB001439.1）同源性都达到99%以上。从GenBank中选取相似菌株利用MEGA4.0软件构建系统发育树（图10），结果表明5株供试菌株在同一分支上，并与NCBI数据库中的标准菌株PSA聚为一类，且置信度达89%。这也说明5株供试菌株并没有因地理位置的不同而产生遗传分化。
3 小结与讨论
国内外对猕猴桃溃疡病的病原有很多研究报道。1983年，美国的Opgennorth[2]经过鉴定确定该病的病原菌为丁香假单胞菌李致病变种（Pseudomonas syringae pv. morsprunorum）。1984年，日本曾报道丁香假单胞菌丁香致病变种（Pseudomonas syringae pv. syringae）为猕猴桃溃疡病的病原菌[1]。1989年，日本的Takikawa等[14]将病原菌认定为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae）。Pseudomonas syringae pv. morsprunorum致病菌对猕猴桃的致病力比较弱，接种后产生的溃疡症状不明显，而Pseudomonas syringae pv. actinidiae对猕猴桃有较强的致病力，除了在枝蔓上接种能够表现出典型的溃疡病症状外，在花及叶片上也能致病，表现出溃疡病的症状。此后，王忠肃等[15]、梁英梅等[16]和承河元等[8]分别对四川、陕西和安徽的猕猴桃溃疡病进行病原鉴定，也认为其病原为丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种。前人研究表明，引起猕猴桃溃疡病的病原细菌的致病变种有不同，这可能与地理分布有关。近年来国内外的报道都倾向于将猕猴桃溃疡病的病原菌确定为Pseudomonas syringae pv. actinidiae[4-9]，不仅从形态学、生理生化方面得到了验证，更为重要的是得到了分子层面的佐证[17，18]。本研究从四川省5市（县）猕猴桃果园的染病猕猴桃枝条中分离到的病菌对猕猴桃致病力强，一些关键的生理生化指标及形态特征、染色反应、致病性测定和分子鉴定均与国内外报道的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种一致。研究结果表明，引起四川猕猴桃溃疡病的病原菌为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。
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